精准医学的新策略——“协同致死”机制及其在胰腺癌中的应用

苏小茉，张美英，郭明洲

中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科医学部，北京 100853

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤，其5年生存率仍低于10%[1]。胰腺癌的发病率呈逐年增长趋势，目前已成为肿瘤致死原因的第3位，预计到2030年，胰腺癌将成为全球第2位的致死性肿瘤[2-3]。胰腺癌很少在40岁以前发生，其平均发病年龄为71岁，随着人口老龄化，我国的胰腺癌发病率也呈快速增长趋势。只有5%～10%的胰腺癌患者能够用遗传因素解释[4]，具有种系突变的基因包括CDKN2A、MLH1、BRCA1、BRCA2、TP53和ATM[1]。对于无法手术的胰腺癌主要是依赖细胞毒性药物，包括FOLFIRINOX、吉西他滨或白蛋白紫杉醇，以及脂质体包裹的伊立替康和5-氟尿嘧啶等。

过去20年对肿瘤的研究主要聚焦于发现肿瘤特异性的信号通路和代谢通路，并针对其进行靶向治疗[5]。到目前为止，批准应用于临床的小分子化合物和抗体主要是针对那些高度依赖具有促癌倾向信号通路的关键基因或蛋白，并且延长了一些难治肿瘤患者的生存期[6-8]。但大多数的靶向药物，如抗血管增生药物(贝伐单抗)、酪氨酸激酶抑制剂(西妥昔单抗)等对胰腺转移癌均无明显治疗效果[1]。部分靶向药物的疗效处于改善的边缘(延长患者生存期≤2个月)，另外一些靶向药物使患者的预后更差，如结合MEK1/2和AKT抑制剂(Selumetinib和MK-2206)比FOLFIRINOX单用的预后更差[9]。令人失望的是，免疫关卡抑制剂PD-L1单抗(Durvalumab)和CTLA-4抗体在胰腺癌中的疗效也非常有限[10-11]。目前正在进行的表观遗传治疗的临床试验，主要是针对表观调控作用的关键分子，虽然其靶向性较强，但由于缺乏肿瘤组织和正常组织之间的明显差别或缺失的证据，除了在部分血液系统肿瘤外，在实体瘤中仍未获得理想的效果[12-13]。也有报道，结合表观治疗和免疫治疗能够克服部分肿瘤的化疗耐药性[14]。胰腺癌的治疗目前仍是一个挑战性的问题。“协同致死”是一个新的概念，它来自于对生物遗传模型的研究。其原理是具有决定细胞命运的两个基因之间具有补偿作用，其中一个基因在肿瘤中发生功能缺失，靶向另一个基因(其伙伴)将特异性地杀伤该肿瘤细胞。该治疗策略选择性地杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞。应用PARP抑制剂能够特异性地杀伤因BRCA1/2突变的乳腺癌细胞是“协同致死”策略的典型代表[15]。

1 DNA损伤修复(DNA damage repair，DDR)机制及其在肿瘤发生发展和治疗中的作用

在自然情况下，每天每个细胞可以通过各种内外因素发生2×105个DNA损伤。外部因素包括紫外线、辐射和基因毒性药物[16-17]，以太阳光来源的紫外线照射为例，每天每个细胞可以诱导1×105个DNA损伤[17-18]。内源性因素多数来自于代谢的副产物，如活性氧。哺乳类动物细胞已经进化出了一些信号通路和机制进行DDR。细胞的轻度DNA损伤可以经过修复而恢复正常；如果DNA损伤不能修复将会通过死亡机制造成死亡而去除。研究表明，DDR系统经常在肿瘤癌变的早期发生功能异常，而造成损伤的DNA不能完全修复产生突变、缺失、插入或其他异常[19]，肿瘤被认为是驱动基因的累积性突变所导致的一种疾病[20]。

在哺乳类动物细胞内存在6种关键的DDR通路，包括直接修复(direct repair)、错配修复(mismatch repair，MMR)、碱基切除修复(base excision repair，BER)、核酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)、非同源末端连接修复(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(homologous recombination repair，HR)[19，21]。肿瘤的关键治疗方法之一，就是利用化疗药物诱导肿瘤细胞的DNA损伤，而肿瘤细胞DDR的缺陷增加其对化疗药物的敏感性[19，22]。

分离和鉴定能够作为药物靶点的癌基因突变已经大大改善了不同肿瘤的治疗效果，如针对EGFR基因突变肺癌的分子靶向治疗[23-24]。目前，绝大多数肿瘤靶向治疗是直接靶向激活性癌基因突变或异常获得的基因功能(gain of function)，包括基因突变、基因扩增和基因融合；不幸的是，非常有限数量的高频基因突变位点能够作为治疗的分子靶标。而且，某些已经明确的基因突变位点或异常表达的基因不能作为直接的分子治疗靶标，如“功能缺失”(loss of function)或因基因突变导致的表达缺失均很难应用药物恢复其活性，并且几乎无成功的例子[13，25-26]。

DDR系统是由具有检测DNA损伤的感应器(蛋白)和下游的效应器组成的，它们依次通过阻滞细胞周期的进展，然后促进DDR。当DNA发生损伤时，细胞周期的关卡将被激活，将其阻滞在G1期、S期和G2/M期[27-28]。当DNA发生损伤时，需要延迟细胞周期的进展，给DNA的修复提供一定的时间。如DNA发生双链损伤时，毛细血管扩张共济失调突变激酶(ataxia telangiectasia mutated kinase，ATM)将被激活，然后通过激活细胞周期检验点激酶2(checkpoint kinase 2，Chk2)而激活G1期关卡，阻滞细胞进入S期[29]。DNA损伤还可通过激活毛细血管扩张共济失调症与Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase，ATR)，然后通过激活细胞周期检验点激酶1(checkpoint kinase 1, Chk1)，而阻滞细胞进入S期[30]。ATR和Chk1也可通过激活G2/M期关卡而阻止DNA损伤的细胞进入有丝分裂期(M期)[31]。当细胞的DNA损伤比较严重而无法修复时，将会促使细胞进入有丝分裂期，通过有丝分裂灾难(maitotic castrophe)机制而导致细胞的死亡[32]。促使发生DNA损伤的肿瘤细胞进入有丝分裂期将会实质性地提高疗效。

2 “协同致死”原理及其在分子靶向治疗中的应用

“协同致死”的概念来源于对果蝇模型的研究，用于描述两个或更多基因同时发生突变而导致细胞的死亡[33]。当肿瘤细胞存在DDR的异常改变时，我们可以应用“协同致死”策略进行精准治疗。其基本原理是，肿瘤细胞中的一个DDR通路存在缺陷时，需要依赖另外的补偿通路而存活，通过阻断其补偿通路将会达到“协同致死”的目的。最经典的例子是在BRCA1/2缺失的细胞，应用PARP抑制剂而诱导细胞的死亡[13，34-36]。BRCA1/2参与DNA的同源重组修复，PARP参与DNA的单链修复，这两个通路互为补偿通路，因此，当BRCA1/2功能缺失时，应用PARP抑制剂将会促进具有DNA损伤的细胞发生有丝分裂灾难而死亡。值得注意的是，“协同致死”原理可以用于探索无法靶向的抑癌基因的突变和直接靶向治疗非常困难的癌基因的分子靶向治疗策略，通过靶向其具有“协同致死”效应的伙伴而获得突破性效果[37]。

为了应对DNA损伤，细胞进化出几个重叠和互补的DDR通路。DNA损伤时，一些关键蛋白参与DNA损伤与细胞周期关卡和DNA修复通路之间的信号传导，例如ATM、ATR和DNA-PKcs[38]。随着对DDR机制的深入理解，新的针对DDR关键分子的靶向治疗成为抗癌治疗的新策略。潜在的治疗靶标很多，约有450个基因编码的蛋白参与DDR。除了PARP1/2抑制剂外，大量的DDR关键分子的抑制剂正在进行临床试验，如：CBP-501和Prexasertib(Chk1/2抑制剂)、AZD-1775(WEE1抑制剂)、AZD-6738和VX-970(ATR抑制剂)、LY-3023414(DNA-PK抑制剂)和AZD-0156(ATM抑制剂)[37，39]。

3 “协同致死”机制应用的新策略——“BRCAness”

在肿瘤中，应用PARP抑制剂治疗BRCA1/2突变的细胞是一个完美的“协同致死”治疗模型，目前几乎所有的“协同致死”研究均局限于BRCA1/2的突变。然而，BRCA1/2突变在多数肿瘤中均非常少见。通过对该模型生物学功能的学习和深度分析，发现任何DDR的关键调控分子的缺陷均可能成为“协同致死”的标志物，如ATM、ATR、PALB2、MGMT、SLFN11、FANCC、GSTpi等。大量不同类型的DDR抑制剂正在进行临床前期或临床试验，但这些DDR抑制剂在“协同致死”中的应用需要进行广泛的研究[22，40]。

Roberti等根据Rad51和BRCA2相互作用而影响DNA双链断裂的同源重组修复功能，通过筛选小分子化合物库获得了40多个三唑衍生物(triazole derivative)能够破坏Rad51-BRCA2之间的相互作用而影响DNA的双链断裂修复，从而模拟了BRCA2的突变。这些三唑衍生物能够和奥拉帕尼(Olaparib)协同靶向杀伤BRCA2功能正常的胰腺癌细胞[41-42]。另外，一些肿瘤相关的信号通路，通过直接参与或通过影响细胞周期而参与DDR，如：PI3K、AKT、Wnt、SMAD4等信号通路[43-44]。弄清DDR通路之间的补偿机制和网络将极大地促进“协同致死”策略在肿瘤中的广泛应用。

绝大多数肿瘤同时具有遗传学和表观遗传学的异常改变，遗传和表观遗传可以相互作用而促进肿瘤的发生和发展[45]。与抑癌基因的失活性突变相似，抑癌基因的表观遗传沉默可以导致其参与的信号通路的功能缺失。因此，表观遗传调控直接参与Knudson的“二次打击”事件，是对Knudson“二次打击”学说的补充[13]。

4 基于遗传和表观遗传异常改变的“协同致死”策略及其在胰腺等肿瘤中的应用

最近的一项研究表明，BRCA1/2种系突变的胰腺癌患者在顺铂治疗后，与安慰剂量组相比，应用奥拉帕尼(PARP抑制剂)维持治疗可以延长患者的无进展生存期(7.4个月vs3.8个月)[46]。另外一项在小鼠和人的胰腺癌模型中针对ATM基因突变的研究发现，ATM功能缺失能够明显增加对PARP、ATR和DNA-PKcs抑制剂的敏感性[47]。在胰腺癌中还有许多DDR相关基因发生突变，这些驱动基因突变有望成为新的“协同致死”治疗的靶标，如ABRAXAS1、APC、BARD1、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、PALB2、PIK3CA、PMS2、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、XRCC2等[48]。

除了经典的DDR基因外，一些涉及细胞周期、Wnt、TGF-β、PI3K等信号通路的关键分子也会直接或间接影响DDR或细胞命运，这些关键基因的表观遗传沉默为肿瘤的“协同致死”治疗策略提供了新的机遇。DDR、细胞周期、Wnt、TGF-β、PI3K-AKT-mTOR和其他信号通路的关键调控因子在许多肿瘤中均频繁发生启动子区的甲基化[45，49-51]。我们过去的研究在胰腺内分泌肿瘤中发现，DDR相关基因MGMT、MLH1 GST-pi和RASSF1A频繁发生甲基化[52]。另外的研究发现，MLH1在胰腺癌中频繁发生甲基化，且其甲基化与微卫星不稳定相关[53]。最近的一项研究发现，BET抑制剂(JQ1)不仅能够抑制同源重组修复相关蛋白RAD51的表达，而且能够抑制非同源重组末端链接修复蛋白Ku80在胰腺癌细胞中的表达。JQ1在体内外均可增加胰腺癌对PARP抑制剂(Veliparib或Olaparib)的敏感性[54]。我们最近的研究发现，NRN1基因在食管癌中的甲基化率为50.4%(510/1 012)，且其表达受启动子区甲基化调控，NRN1在体内外通过抑制PI3K-mTOR信号通路而抑制食管癌的生长，进一步的研究发现，NRN1甲基化是PI3K和ATR抑制剂的“协同致死”标志物[55]。我们在胰腺癌和癌前病变中发现DDR基因MGMT、MLH1、CHFR、SLFN11和RASSF1A频繁发生甲基化，为胰腺癌的“协同致死”治疗提供了依据。

5 展望与挑战

针对蛋白之间的相互作用进行靶向治疗是一个极具吸引力的药物设计策略，但鉴定和优化相互作用蛋白质之间的特异抑制剂是一项非常困难的工作，因为这些蛋白常常与其他蛋白之间相互作用，使得根据其结构特点获得最佳配体非常困难[41]。

表观遗传学改变在一定条件下可以逆转，这一特性为肿瘤的治疗提供了新的机遇。目前常用的表观遗传治疗，主要是针对表观遗传调控的关键分子，如甲基化酶抑制剂5′-Aza、HDAC抑制剂FK228和EZH2的抑制剂DZNep/GSK126等。虽然在血液系统肿瘤治疗中获得了一定的效果，但在实体瘤中的效果尚不明显，且由于其靶向组织的非特异性导致比较明显的毒副作用。如何靶向特定肿瘤组织中特定基因的启动子区是一个尚未解决的难题。基于表观遗传异常的“协同致死”治疗策略，是通过靶向表观遗传异常通路的补偿通路，而特异性的杀伤表观遗传异常的肿瘤细胞而不影响正常细胞。在许多肿瘤中DDR基因和细胞周期调控的关键基因也发生频繁甲基化[19，49]。因此，基于表观遗传异常的“协同致死”治疗策略将具有更广泛的应用前景[13，22]。