别旁茶总苷抗溃疡性结肠炎的网络药理学与分子对接研究

王晓玉，张飞宇，刘莉，何新月，王凤云

（1.广东药科大学健康学院，广东广州510310；2.广东省光与健康工程技术研究中心，广东广州510310；3.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性易发的非特异性炎性肠道疾病[1⁃2]，其发病率近5年来急剧上升，医疗费用高，且会增加结直肠癌死亡的风险，已成为一种全球性疾病[3⁃5]。水杨酸抑制剂、糖皮质激素及免疫抑制剂等为UC治疗的常规药物，在一定程度上可缓解及改善UC的症状，但服药周期长、疗效欠佳，药物不良反应严重，且停药后易复发，在临床应用上有一定局限[6-7]。而传统民族药在治疗慢性病上发挥重要作用，且相对西药副作用小[8⁃11]，比较适合新药研究开发。

别旁茶（瑶药名），也称扭肚藤、断骨草、猪肚勒花等，为木犀科素馨属植物扭肚藤Jas minum elon gatum(Bergius)Wiid.的干燥嫩茎及叶，是民族医药瑶医瑶药中常用的药物[12]。其性微苦、凉，功效清热解毒、利湿消滞，用于治疗急性胃肠炎、消化不良、痢疾等。动物实验证实其复方制剂复方扭肚藤胶囊对实验性腹泻的治疗有良好效果[13]。别旁茶更是作为中成药腹可安的主药，在临床中广泛应用于腹痛、腹泻、呕吐等消化系统疾病的治疗，并且对肠易激综合征患者有较好的治疗作用[14]。因为其含有东莨菪素成分可镇静消炎[15]，提取物还可以显著改善结肠组织学损伤，抑制炎症[16]。前期研究使用超高效液相色谱⁃飞行时间串联质谱法（UPLC/Q⁃TOF⁃MS法）鉴定别旁茶29种化合物中26种均为苷类[17]。本研究使用网络药理学与分子对接的方法系统研究BPC治疗UC的活性成分及其作用靶点，为民族药别旁茶的深度开发提供数据基础和科学依据。

1 资料与方法

1.1 别旁茶苷活性成分的获取与收集

运用Pubchem数据库（pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov）筛选11种环烯醚萜苷类化合物[17]并结合使用Swiss target prediction数据库(http://www.swisstar⁃getprediction.ch/)进行靶点预测，以P＞0.05进行相关靶点筛选。将最终获得化合物的蛋白靶点，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中的ID map⁃ping进行官方名称校正。

1.2 疾病靶点与有效化合物靶点的筛选与收集

通过Genecard数据库（https://www.genecards.org/）、DisGeNET数据库(http://disgenet.org/)搜集UC相关疾病靶点，将疾病靶点与化合物靶点取其两者共同交集，导入Cytoscape 3.6.0软件构建“成分—靶点—疾病”网络。

1.3 疾病与药物的差异基因分析

将获得的共同靶点通过STRING数据库（https://string⁃db.org/）构建PPI网络模型，之后导入Cyto⁃scape 3.6.0，利用Cytoscape插件CytoHubba寻找排名前10的差异表达基因。

1.4 Go分析与KEGG通路富集分析

运用DAVID6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）将“1.3”项下获得的关键共同靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析。其中以参数P＜0.05，设定为HOMO species筛选出count值前10个来分析生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular⁃function,MF）、细胞组成（cellular component,CC）的GO富集功能和KEGG信号通路。最后用易汉博生物在线网站做气泡图进行分析数据。

1.5 核心有效成分与靶点的对接

使用AutoDock分子软件将差异表达排名前4位的靶点与6种别旁茶苷核心活性成分进行分子对接分析，结合能越低说明结合程度越紧密。

2 细胞体外试验验证

2.1 材料与细胞株

别旁茶苷（Jasminoside，HPLC≥96%，成都Alfa Biotechnology Company Limited）;Caco⁃2细胞(中科院上海细胞库)；1640基础培养基(Life Science公司，批号：AC11225278)；FBS（Gibico公司，批号：42F2362K）；双抗（Gibico公司，批号：1881459）；胰酶（TRYPSIN）(VWR amreso Life Science，批 号：0106C059)；MTT(Sigma公司，批号：MKCB8895)；Rabbit anti⁃NF⁃κBp65(Cell signaling technology公司，批号：9);β⁃actin Mouse mAb(博 士 德 公 司，批 号：BM0627)；TransAMNF⁃κBp65试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：220680351）。

2.2 方法

2.2.1 Caco⁃2细胞培养 应用10%（体积分数，下同）胎牛血清的1640培养液，将Caco⁃2细胞在37℃、5%CO2培养箱条件下进行培养，3～4 d可基本融合。取对数期细胞用于实验，实验时对细胞进行常规消化、计数。

2.2.2 炎症细胞模型的筛选

2.2.2.1 IL⁃1β诱导模型的筛选 将Caco⁃2细胞培养24 h，分为正常对照组、模型组，加入10 ng/mL IL⁃1β分别刺激0.5、1、3、12 h后，收集细胞。采用Trans AMNF⁃κBp65试剂盒检测各时间点的细胞核蛋白NF⁃kBp65的含量，确定IL⁃1β最佳刺激时间点。

2.2.2.2统计分析 采用GraphPad prism 8.0分析软件进行统计分析，使用单因素方差分析(One⁃WayANOVA)检验比较各组间显著性差异，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2.2.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测别旁茶总苷对Caco⁃2细胞活性的影响 取细胞密度达到80%～90%的Caco⁃2细胞，按5×105个/mL接种于96孔板中，每孔180μL，随后置于恒温培养箱中，待4 h后，细胞贴壁，对细胞进行分组：Control组，别旁茶苷浓度梯度组（6.25、12.5、25、50、100、200 mol/L）每组设置6个复孔，Control组每孔加入20μL基础培养基，别旁茶苷梯度组每孔加入20μL相应浓度10倍的别旁茶苷溶液。孵育20 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT储备液10μL，继续孵育4 h，孵育结束后，取注射器小心吸弃上清，再加入150μL二甲基亚砜，于震板仪上充分溶解甲臜结晶10 min后，在波长分别为490、630 nm处检测其吸光值，并计算。

2.2.4 Western blot检测别旁茶苷对Caco⁃2细胞NF⁃κB p65蛋白表达的影响 取对数生长期的Caco⁃2细胞，按1×106个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL，铺板均匀后，置于恒温培养箱。贴壁过夜，对细胞分为3组：Normal组、模型组、别旁茶苷梯度组。弃去培养基，PBS清洗1次后，Normal组、模型组加入完全培养基，别旁茶苷梯度组进行别旁茶苷处理24 h。24 h后，加入IL⁃1β刺激0.5 h，弃去培养基，1 mL PBS清洗2次，用细胞刮刮取细胞至离心管中，在1 260 r/min、4℃条件下，离心5 min，弃去上清液，按蛋白提取试剂盒说明书提取细胞核蛋白并检测蛋白浓度，按4∶1加入5×Loading Buffer，在95℃以上水浴加热5 min，得Western Blot实验样品。Western Blot具体实验步骤参照文献[30]进行。

3 结果

3.1 化学成分筛选与靶点预测

运用Pubchem数据库并结合Swiss target predic⁃tion数据库筛选出8种活性化合物，基本信息见表1。分别预测所有单体活性成分，共得到靶点139个，导入Cytoscape 3.2.1软件，将别旁茶苷8种有效成分和139个有效靶点建立可视网络拓扑图，见图1。

表1 别旁茶苷有效活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of the effective active compounds in BPC

3.2 别旁茶苷抗溃疡性结肠炎的关键靶点分析

通过GeneCard、DisGeNET与TTD数据库搜集靶点，去重后获得UC靶点，运用score中位数筛选出靶点，易汉博生物信息网站在线做Venn图，取疾病靶点与化合物靶点二者的共同交集，详细信息见图2。获得共同关键靶点有139个，将获得共同靶点通过STRING数据库构建PPI网络模型，之后将数据导入Cytoscape 3.6.0进行可视化分析。运用Cytoscape插件CytoHubba找到差异表达基因，颜色越深越重要，如图3所示。其中排名前4的分别是CASP3、EGFR、SRC、MMP9。

3.3 药物⁃靶点⁃疾病共同靶点的网络构建

将TNF⁃α、NMUR2、ADRA2A、ACHE、AKR1B1、CA7、CA12、CA4、CA2、NOX4、RPS6KA3等靶点导入Cytoscape 3.6.0软件构建“化学成分-共同靶点-溃疡性结肠炎”PPI网络图，见图4，可判断出三者的相互作用关系。

图1 别旁茶苷活性成分靶点图Figure 1 Target map of the effective active compounds in BPC

图2 别旁茶苷与溃疡性结肠炎的韦恩图Figure 2 Venn diagram of BPC and ulcerative colitis

图3 别旁茶苷治疗溃疡性结肠炎排名前10靶点Figure 3 Top 10 targets for BPC treatment of ulcerative colitis

图4 化学成分-共同靶点-溃疡性结肠炎的PPI网络图Figure 4 PPI network diagram of Chemical composition⁃common target⁃ulcerative colitis

3.4 别旁茶苷抗溃疡性结肠炎的核心通路筛选

将“1.3”项下获得的关键共同靶点导入DAVID 6.8数据库进行GO功能与KEGG通路富集分析。获得生物过程（biological process，BP）217个，主要涉及信号传导、负调节凋亡过程、氧化还原过程等。分子功能（molecularfunction,MF）获得78个，主要涉及蛋白结合、锌离子结合、蛋白激酶活性等。细胞组成(cellular component，CC)获得37个，质膜、胞质、细胞质、膜的整体组成部分、细胞外来体、核浆、细胞外空间、原生质膜的组成成分、细胞外区域等。通过易汉博生物在线作图，以count值前10与P值≤0.05进行筛选，筛选结果见图5。KEGG信号通路有119个，主要与NF⁃kappa B信号通路、癌症通路、蛋白多糖、PI3K⁃Akt信号通路、神经活性配体⁃受体相互作用、鞘脂信号通路、Rap1信号通路等有关。以count值前10与P≤0.05为标准，筛选结果见图6。

3.5 核心活性与靶点的分子对接验证

找到重要6种活性化合物（山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖苷、橄榄苦苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B），将BPC治疗UC差异表达排名前4的基因（CASP3、EGFR、SRC、MMP9）进行分子对接，其中靶点基因与蛋白间活性的结合能等信息见图7。结合能越低，说明活性成分与靶点受体结合越紧密，显示苜蓿素与前4靶点结合方式较为相似，且结合能优于阳性药物美沙拉嗪，均落于靶点受体的活性中心内，见图8。

图5 别旁茶的活性成分靶点的GO富集分析图Figure 5 GO enrichment analysis diagram of active ingredient target in BPC

图6 别旁茶抗UC作用靶点的KEGG富集分析图Figure 6 KEGG enrichment analysis diagram of BPC anti⁃UC target

图7 关键靶点与别旁茶苷成分的结合能热图Figure 7 Heat map of the binding energy of key targets and BPC components

图8 关键靶点与苜蓿素的分子对接（与阳性药比较）Figure 8 Molecular docking between key targets and alfalfa(compared with positive drugs)

3.6 细胞体外实验验证

3.6.1 别旁茶苷实验浓度的确定

别旁茶苷实验浓度确定结果见图9。与正常对照组比较，浓度为12.5、25、50μmol/L的别旁茶苷对细胞活性没有影响(P＞0.05)，而别旁茶苷浓度为100、200μmol/L时对细胞活性抑制明显(P＜0.05)，故将12.5、25、50μmol/L确定为别旁茶苷的实验浓度，用于后续实验。

图9 别旁茶苷实验浓度的考察Figure 9 Experimental concentration of BPC

3.6.2 IL⁃1β诱导的Caco⁃2细胞NF⁃κBp65蛋白的相对含量

IL⁃1β刺激细胞各时间点NF⁃κBp65蛋白含量均高于正常对照组，其中刺激0.5 h细胞NF⁃κBp65蛋白含量最高，故确定IL⁃1β最佳刺激时间点为0.5 h，见图10。

图10 IL⁃1β诱导的Caco⁃2细胞细胞NF⁃κBp65蛋白相对含量Figure 10 The relative content of NF⁃κBp65 protein in Caco⁃2 cells induced by IL⁃1β

3.6.3 别旁茶苷对IL⁃1β诱导的NF⁃κB信号通路活化的影响

该部分对IL⁃1β激活的经典炎症信号通路NF⁃κB通路进行检测。由“3.6.2”项下数据确定使用IL⁃1β刺激细胞0.5 h作为炎症模型，别旁茶苷对IL⁃1β诱导的NF⁃κB信号通路活化的影响结果见图11。与正常组比较，模型组IL⁃1β能明显诱导NF⁃κB信号通路活化，增加通路核蛋白NF⁃κBp65的表达，且具有统计学意义。而与模型组比较，别旁茶苷可以明显缓解细胞核NF⁃κBp65的表达，且具有剂量依赖性。

图11 别旁茶苷对NF⁃κBp65蛋白表达的影响Figure 11 The effect of BPC on the expression of NF⁃κBp65 protein

4 讨论

UC发病具有症状多样性、非特异性、发病较为隐匿、病因不明确等特点，给临床治疗带来很大的难度，如何做到个体化治疗或未病先防，是目前有待解决的医疗难题。中医可根据UC患者体质的差异进行辨证施治，同时还能做到未病先防，在治疗UC方面具有独特的优势[18⁃19]。瑶药别旁茶的药理研究主要集中在肠胃炎、湿热痢疾、肠胃消化等几个方面，临床上可作为中成药腹可安的主药，其许多化合物都具有抗感染作用[20⁃21]。前期研究使用UPLC/Q⁃TOF⁃MS法鉴定出别旁茶含有29种化合物[17]，通过Swiss target predictiony分析（P≥0.05）筛选出山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖苷、橄榄苦苷、jaspogeranoside A、素馨苦苷⁃O⁃β⁃D⁃葡萄糖苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B为主要核心活性化合物。

PPI网络分析结果显示TNF、PTGS1、MAPK14、CXCR1、LGALS3、IL⁃2等靶点与UC有关，其中TNF、PTGS1是促炎性细胞因子，CXCR1是IL⁃8的受体，IL⁃2是抑炎细胞因子[22⁃23]。提示别旁茶苷中化合物可能通过调节炎性细胞靶点进行抗UC。大量、难以控制的出血成为UC症状，而别旁茶苷可作用于KDR、CA2、MMP2等多个靶点以调节血管[24]。

氧化脂质衍生物能激活NF⁃κB[6]，诱导单核细胞结合到内皮细胞，导致炎症形成。而别旁茶苷可能通过激活PXR、CYP3A抑制NF⁃κB的表达，从而促进消化系统功能，调节脾胃，止血止泻，降低炎症因子TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β和TGF⁃β1的水平，发挥保护作用[25⁃28]。本研究筛选出NF kappa B signaling pathway、Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer等119条通路，其中NF⁃κB信号通路排名前列，通过体外细胞实验筛选结果得知，别旁茶总苷确能降低IL⁃1β诱导的炎症细胞核蛋白NF⁃κBp65的含量，且呈现一定的剂量依赖性，与本文网络药理学预测的假设具有一致性。

分子对接结果分析显示，CASP3、EGFR、SRC、MMP9是别旁茶苷的差异靶点蛋白，它们与6种核心活性化合物的结合较为紧密，其中苜蓿素结合能优于阳性药美沙拉秦，这进一步提示别旁茶总苷通过NF⁃κB发挥UC治疗作用的可行性。此外，别旁茶苷类成分在临床应用还需更多体内实验验证。

本研究应用网络药理学和分子对接方法探讨了别旁茶苷抗UC作用主要靶点和信号通路，结果表明别旁茶苷类成分苜蓿素具有潜在研究价值。另体外细胞实验显示，别旁茶总苷确能降低NF⁃κBp65的表达，这为民族药的实验研究及产品开发提供了科学依据。