MicroRNA在幽门螺杆菌阴性胃癌中的研究进展*

王 璐 李学良

南京医科大学第一附属医院消化内科(210029)

胃癌是常见的上消化道恶性肿瘤之一，尽管在过去的50年中，胃癌的发病率和死亡率在世界范围内有所下降，但仍是第三大癌症相关死亡原因[1]。早期一项前瞻性队列研究[2]表明，胃癌仅发生在幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)感染阳性患者中。然而后续的研究结果显示，在部分胃癌患者中未发现Hp感染的证据，该类型胃癌被定义为幽门螺杆菌阴性胃癌(Helicobacterpylori-negative gastric cancer, HpNGC)[3]。与幽门螺杆菌阳性胃癌(Helicobacterpylori-positive gastric cancer, HpPGC)相比，HpNGC具有不同的临床病理特征和预后[3-4]。说明HpNGC的发病机制可能与HpPGC并不完全相同。

已有研究表明HpNGC和HpPGC之间存在差异表达的microRNA(miRNA)，说明miRNA在HpNGC的发病中起有重要作用[5-6]。MiRNA是一种内源性非编码小RNA，存在于真核细胞中，由21～25个核苷酸组成[7]，可调节慢性炎症性疾病和各种肿瘤性疾病的发生。正确认识HpNGC并深入了解相关miRNA在其中的致病机制，有助于阐明HpNGC相关的生物学标志物以及新型治疗靶标的鉴定。本文就HpNGC中差异表达且起致病作用的miRNA及其机制和相关治疗靶点作一综述。

一、HpNGC的概述

1. HpNGC的定义和诊断：HpNGC定义为无Hp现症感染、既往感染和既往可疑感染时所发生的胃癌。结合既往研究文献，诊断HpNGC需同时满足以下条件[3,8]：①无Hp现症感染：快速尿素酶试验、尿素呼气试验、组织切片染色镜检等检查至少一项为阴性；②无Hp既往感染：无Hp感染史和根除史，且血清Hp抗体为阴性；③无Hp既往可疑感染：a. 无组织病理学萎缩和肠化生；b. 无内镜下萎缩，且胃体下部有规律排列的小静脉；c. 无血清学萎缩，即血清胃蛋白酶原(pepsinogen, PG)检测阴性(PGⅠ>70 ng/mL，PGⅠ/Ⅱ>3.0)。

目前研究表明胃黏膜萎缩和肠化生主要由Hp感染引起[9-10]。严重的萎缩和肠化生会导致Hp无法定植而自发消失[11]，且由于抗菌药物治疗其他疾病时可能会意外根除Hp[12]，故临床检测Hp感染会出现假阴性结果，因此评估胃黏膜萎缩是有必要的。目前发现严格定义下的HpNGC患病率为0.42%～5.4%[3-4]。

2. HpNGC的病因：关于HpNGC的病因和发病机制目前尚不完全明确。除Hp感染外，目前已知胃癌的患病风险与多种因素有关，其中生活方式因素占主导作用。一项在中国胃癌高危地区进行的配对病例对照研究[13]表明，吸烟、反流、情绪经常较差增加了HpNGC的发病风险。此外，病毒感染、自身免疫病、家族聚集性和种系突变等因素也可能导致了HpNGC的发生。

二、HpNGC中差异表达的miRNA

多种miRNA在HpNGC与HpPGC之间存在差异表达，可作为研究胃癌发生和预后的分子基础。了解miRNA在HpNGC中的致病机制并鉴定早期诊断标志物，对HpNGC分子遗传学的进一步研究至关重要。目前发现在HpNGC中表达上调的miRNA包括miR-204-5p、miR-338-5p、miR-135b-5p、miR-93、miR-372、miR-122、miR-455、miR-200a-5p、miR-943、miR-25等；在HpNGC中表达下调的miRNA包括miR-99b-3p、miR-564、miR-143-3p、miR-145-5p、miR-146a、miR-302a、miR-302b、miR-196b、miR-138等[5-6,14-19]。

三、在HpNGC中表达上调的miRNA

1. MiR-338-5p：Chang等[5]的研究应用miRNA微阵列检测8例HpNGC和8例HpPGC组织标本之间miRNA的表达谱，结果显示miR-338-5p在HpNGC组织中的表达增高，而在HpPGC中表达降低。MiR-338-5p已被确定为胃癌的潜在调节因子，与胃癌患者较短的总生存期和无复发生存期有关[20]。由此推测，miR-338-5p过表达可能与HpNGC患者预后不良有关。

2. MiR-25：Abdi等[19]发现miR-25在HpNGC中表达上调，而在HpPGC中表达降低。Ning等[21]的实验证实miR-25-3p过表达在体外可显著促进胃癌细胞生长和侵袭，在体内抑制miR-25-3p表达可抑制肿瘤的发生。Kong等[22]证实胃癌血清miR-25高表达与较晚的疾病分期显著相关。在按肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移分层的亚组分析中，高血清miR-25水平与预后不良相关。He等[23]的研究发现miR-25表达在顺铂耐药的胃癌细胞中上调，并通过抑制FOXO3a表达以促进细胞周期进程。抑制miR-25表达可导致细胞周期阻滞，并增强胃癌细胞对顺铂的化疗敏感性。由此推测，靶向miR-25可能是治疗HpNGC肿瘤转移和顺铂耐药的有前景的方法。

3. MiR-135b-5p：Lee等[6]的研究发现miR-135b-5p在HpNGC和HpPGC中的表达均明显增加，但在HpNGC中的表达约为HpPGC中的3倍，说明两者存在着部分相同的致癌机制。Chen等[24]的研究发现Krüppel样因子4(KLF4)是miR-135b-5p的靶点，miR-135b-5p通过靶向并下调KLF4在胃癌细胞中的表达，从而发挥促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和有丝分裂以及降低细胞凋亡的作用，因此抑制miR-135b-5p表达对HpNGC有治疗价值。Lu等[25]的研究结果显示，CMTM3为miR-135b-5p的另一直接靶点，miR-135b-5p过表达可抑制CMTM3表达，促进胃癌的进展和转移。MiR-135b-5p/CMTM3轴的发现为预测HpNGC预后、开发治疗策略提供了一个新的方向。

4. MiR-93：Liu等[15]的研究构建了HpNGC和HpPGC的竞争内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络，结果发现HpNGC ceRNA网络中存在9种特有的miRNA，其中miR-93在调控网络中RNA的相互作用数中位列第一，推测其可能是中枢基因，在整个网络和疾病发生中发挥重要作用。Guan等[26]发现胃癌组织中miR-93高表达与较高的TNM分期显著相关。在功能上，miR-93的异位表达在体外可促进细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，并抑制细胞凋亡和G1细胞周期阻滞，在体内促进肿瘤形成。进一步实验结果表明，TIMP2是miR-93的直接靶标，miR-93通过靶向TIMP2在胃癌发生中起着肿瘤启动子的作用。Shen等[27]发现miR-93-5p过表达通过靶向下调AHNAK表达来激活Wnt信号通路，并可抑制典型上皮细胞标志物E-cadherin表达而增加间质标志物vimentin和Snail表达，从而促进胃癌的EMT。EMT是分化的上皮细胞失去上皮特征并获得间充质细胞迁移性的生物过程，是肿瘤转移过程中的重要环节，可增强细胞迁移和侵袭能力，与癌症的侵袭和转移过程密切相关。由此可见，miR-93可能在HpNGC的发生和进展过程中起有举足轻重的作用，有望成为HpNGC诊断的生物学标志物和治疗靶标。

5. MiR-372：MiR-372是HpNGC调控网络中特有的miRNA之一，其在HpNGC中的表达上调[17]。Zhou等[28]的研究结果显示miR-372直接靶向并下调TNFAIP1表达，参与调节NF-κB信号通路，促进胃癌细胞增殖并抑制细胞凋亡，在控制细胞生长和凋亡中起致癌作用。Wang等[29]发现，上调miR-372表达可靶向调控FOXO3a并抑制其表达，促进胃癌细胞增殖，减少凋亡并可增强顺铂的耐药。Pan等[30]的研究发现ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2可能为胃癌的潜在调控轴，在胃癌的发病中起有关键作用。上述研究提示miR-372、ADAMTS9-AS2/miR-372/CADM2轴可作为HpNGC治疗的潜在靶点，并有望解决HpNGC化疗耐药的问题。

四、在HpNGC中表达下调的miRNA

1. MiR-146a：Shomali等[16]的研究表明miR-146a在HpNGC中表达下调，而在HpPGC中上调，并可促进HpNGC细胞迁移；功能研究表明miR-146a是一种肿瘤抑制因子，其低表达预示着较差的无复发生存率。Kipkeeva等[31]发现miR-146a表达降低与胃癌区域淋巴结转移和远处转移的发生有关，可作为胃癌转移风险的生物学标志物。Chen等[32]的研究发现miR-146a可通过靶向TAK1抑制NF-κB信号通路，从而促进胃癌细胞凋亡。在化疗和预后方面，Luo等[33]发现miR-146a通过调节其靶基因LIN52影响晚期胃癌的化疗敏感性和预后，miR-146a低表达的肿瘤患者的化疗敏感性和预后均较差。由此可见，miR-146a可作为HpNGC抗转移替代治疗的候选基因。

2. MiR-143-3p：Wang等[14]的研究发现与邻近非癌组织相比，HpNGC中miR-143-3p表达降低，而在HpPGC中的表达升高，并发现AKT2是miR-143-3p的功能靶点。MiR-143-3p通过直接靶向AKT2基因来调控肿瘤的生长、迁移和侵袭，是一种肿瘤抑制性miRNA。MiR-143-3p表达下调可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并促进细胞迁移和侵袭。该研究还发现miR-143-3p低表达与临床分期和肿瘤转移密切相关，导致HpNGC患者的预后较差。Fan等[34]发现lncRNA CCDC144NL-AS1可海绵化miR-143-3p，并上调其直接内源性靶基因MAP3K7在胃癌中的表达，从而促进细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡，在胃癌发生、发展中起致癌的作用。CCDC144NL-AS1/miR-143-3p/MAP3K7轴为进一步探究HpNGC的发病机制和治疗提供了启示。

3. MiR-145-5p：Lee等[6]的研究发现与非癌组织相比，HpNGC中miR-145-5p表达明显降低，而在HpPGC中表达无明显变化。Jiang等[35]的研究提示miR-145-5p活性降低与EMT的增加有关。MiR-145-5p可通过直接靶向N-cadherin和ZEB2来抑制EMT，从而抑制胃癌细胞侵袭和迁移。MiR-145-5p作为抑癌基因，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关，因此其表达下调与患者较差的预后相关。Teng等[36]发现SERPINE1为miR-145-5p的靶标，lncRNA NKX2-1-AS1表达在胃癌细胞株和肿瘤组织中上调，其充当负调控miR-145-5p的ceRNA。LncRNA NKX2-1-AS1/miR-145-5p轴可诱导SERPINE1的翻译，从而激活VEGFR-2信号通路，促进肿瘤进展和血管生成。Zhou等[37]证实了ANGPT2为miR-145-5p的另一靶标，miR-145-5p过表达可通过抑制ANGPT2来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。上述研究结果表明NKX2-1-AS1/miR-145-5p/SERPINE1轴和miR-145-5p/ANGPT2/Nod样受体轴可能为HpNGC潜在的治疗靶标。

4. MiR-138：Yang等[18]的研究发现miR-138在HpNGC中表达下调。Pang等[38]的实验证实SOX4是miR-138在胃癌细胞中的直接靶点，而SOX4是EMT的主要介导因子。蛋白质印迹法结果显示miR-138过表达通过上调上皮标志物E-cadherin、下调间质标志物N-cadherin和vimentin来抑制胃癌细胞的EMT进程。功能分析表明，miR-138过表达抑制了胃癌细胞的体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭，并可抑制体内肿瘤的生长；而胃癌中miR-138低表达与TNM分期有关。提示miR-138可作为HpNGC的治疗靶点。Sun等[39]的研究结果证实miR-138为lncRNA MCM3AP-AS1的下游靶标，lncRNA MCM3AP-AS1通过海绵化miR-138，从而上调FOXC1的表达来促进胃癌对顺铂的耐药性。上述研究可能为HpNGC的治疗和化疗耐药提供一种新的解决途径。

5. MiR-196b：MiR-196b表达和功能的研究结果仍存在争议。Yang等[18]的生物信息学分析和实验发现HpNGC中miR-196b表达明显低于HpPGC。生存分析表明，miR-196b-3p与胃癌患者的预后显著相关，miR-196b-3p表达较低的患者预后较差。相反，Abdi等[19]的研究发现miR-196b在HpNGC中表达上调，而在HpPGC中表达降低。Li等[40]的研究证实miR-196b表达上调可通过调节PI3K/AKT/mTOR途径来促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力。由此可见，miR-196b在HpNGC中的表达和作用仍需行进一步的研究。

由于既往研究中纳入的病例存在对HpNGC定义不严格的问题，部分差异表达的miRNA(如miR-196b)在不同研究中的表达呈相反的趋势。因此HpNGC中差异表达的miRNA及其致病机制的研究仍需结合严格的诊断标准行进一步探讨。

五、LncRNA-miRNA-mRNA在HpNGC中的分析

将miRNA置入其发挥作用的网络中来研究HpNGC的发病机制具有重要意义。一个或多个miRNA应答元件被mRNA和lncRNA共享，lncRNA可作为天然的miRNA海绵，导致细胞内miRNA功能的下调[41]。由lncRNA-miRNA-mRNA构建的ceRNA网络在癌症的发生、发展、侵袭和转移中起重要作用。

Liu等[15]构建了HpNGC和HpPGC的ceRNA调控网络以探究两者间的差异，并首次报道了miRNA在HpNGC的ceRNA网络中的关键作用。结果显示HpPGC中三种差异表达的RNA数量均少于HpNGC，说明HpNGC具有较高的异质性。进一步GO分析显示HpNGC富集于细胞分化、细胞周期、凋亡过程、血管发育和ERK级联；KEGG通路富集分析发现，HpNGC的ceRNA网络的独特通路包括细胞周期、肌动蛋白细胞骨架的调节和环磷酸腺苷信号通路。这项研究结果可能为进一步探究miRNA和ceRNA网络在HpNGC中独特的致病机制提供了依据。

六、小结与展望

Hp感染是目前胃癌的主要致病因素，然而随着人们对Hp根除治疗的重视，HpNGC的患病率未来将有上升的趋势，并有可能成为更常见的胃癌类型。因此需要深入认识HpNGC，并针对HpNGC制定新的癌症预防、治疗策略。由于目前HpNGC发病率低，既往部分研究对HpNGC的纳入标准的制定并不严格，未来应进行严格纳入标准的大样本研究，从而更有利于准确探究HpNGC差异表达的miRNA和其他分子标志物。目前对于HpNGC的病因、危险因素和致病分子机制的相关研究较少，进一步找寻HpNGC的患病高危因素并探究其发病的分子机制对未来胃癌的预防和治疗有重要意义。