薄层色谱原位富集显微拉曼检测荧光增白剂

许凤，孙革，孙明睿，李莉，贾首时，李红梅

1. 齐齐哈尔医学院药学院（齐齐哈尔 161006）；2. 齐齐哈尔市疾病预防控制中心（齐齐哈尔 161006）

荧光增白剂（FWAs）是一种光学增白剂，它的增白原理不同于化学氧化增白，而是通过吸收环境中的紫外线，放出蓝紫色荧光，与需要增白的底物放出的黄色光叠加形成白色光，给人以产品洁白的感觉，同时也可以增加产品亮度。FWAs的这一优良特点使它广泛应用于纺织品、纸张、合成洗涤剂等生产领域，但由于FWAs是一种结构复杂的有机化合物，能和伤口处的蛋白质结合从而阻碍伤口的愈合，一旦FWAs在人体内富集到一定浓度，可能会诱发癌变[1]。研究表明，某些FWAs会引起人体过敏反应及光致诱变效应[2-3]。应用于纸质食品包装材料中的FWAs主要为双三嗪氨基二苯乙烯型（DSD-FWAs）[4]，如荧光增白剂71（C.I.71）和荧光增白剂113（C.I.113），结构如图1所示。

图1 C.I.71和C.I.113结构式

国内外关于FWAs的检测方法[5-12]主要有荧光分光光度法、紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱法-质谱联用法等。

薄层色谱法操作简单，无需复杂的仪器和设备，但多个成分之间经常会有干扰，易导致假阳性的情况，一般需要运用专属性更高的方法予以进一步确认。试验采用薄层色谱（TLC）初步分离一次性纸杯中非法添加的C.I.71和C.I.113，联用micro-Raman[13-14]的高灵敏度和高专一性对非法添加物快速检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DXRxi显微拉曼成像光谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）；碎纸机（深圳奥士达电子有限公司）；高速粉碎机（上海利闻科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海一恒科学仪器有限公司）；UP50超声波清洗器（南京垒君达超声电子设备有限公司）；WFH-203B型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；TLC硅胶60F254铝板（德国默克公司）；薄层点样毛细管（4mL，天津思利达色谱技术公司）。

C.I.71对照品（批号AP180611-03）、C.I.113对照品（批号XZ180628-09）（斯坦福分析化学有限公司）；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氨水、无水乙醇、冰醋酸、环己烷、正丙醇、异丙醇、乙腈（均为分析纯）；7批一次性纸杯（市售品）。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液的制备

取适量C.I.71和C.I.113对照品，精密称定，加入40%乙腈水溶液使其溶解，制成质量浓度5 μg/mL对照品溶液及混合对照品溶液，备用。

1.2.2 样品溶液的制备

将一次性纸杯样品展开成平板状，通过碎纸机将样品逐份粉碎成纸屑，将纸屑全部转移至高速粉碎机中，盖紧粉碎机盖子，以10 000 r/min转速粉碎6次，每次约15 s，将纸屑粉碎成纤维状，每次粉碎后需使用勺子将纸屑碎末搅匀，用干净的聚乙烯塑料袋盛放纤维状纸屑，外面套上一个密实袋，编号，室温下于黑暗处保存备用。

称取0.500 g粉碎均匀的样品纸屑至50 mL聚乙烯塑料离心管中，拉紧实验室窗帘并关闭实验室日光灯，使试验环境处于避光状态（要求照度小于20 Lux）。加入25 mL 40%乙腈溶液，在50 ℃水浴下超声提取35min，提取结束后，以4 000 r/min转速离心5 min。转移上清液至旋转蒸发仪中，于纸屑中分2次加入12.5 mL 40%乙腈溶液，按照上述提取步骤提取10 min，重复2次，合并前后3次的上清液，在50 ℃水浴中旋转蒸发近干，用40%乙腈定溶至0.5 mL，于阴暗处保存，备用。

1.2.3 模拟阳性样品溶液的制备

采用HPLC法检测市售样品，筛选不含C.I.71和C.I.113的样品作为阴性样品。按1.2.2的前处理方法得粉碎后的纸屑，称取适量，分别精密称取适量C.I.71和C.I.113对照品加入其中，混匀，使每种成分含量均为5 mg/kg，制得相应的模拟阳性样品；分别制备模拟阴性与模拟阳性样品溶液。

1.3 试验方法

以硅胶60F254铝板为固定相，以甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）为展开剂，点样量4 μL，饱和5 min后展开、取出晾干，在紫外灯254 nm和365 nm下检视定位。将TLC板上的目标斑点通过无水乙醇从斑点两侧向中心原位富集成相交的弧形细线以提高目标物分子密度[15]，进行显微拉曼光谱检测。光谱采集条件：激光光源波长532 nm，激光功率10.0 mW，曝光时间0.050 00 s，扫描次数30次，显微镜倍数10倍，图像像素5.0 μ m，共聚焦针孔光阑25 μ m，扫描方式为区域点扫；数据采集及分析软件为OMNICxi，采用Origin 6.1制图。

2 结果与分析

2.1 展开剂的选择

C.I.71与C.I.113均属双三嗪氨基二苯乙烯型（DSDFWAs）荧光增白剂中的二磺酸型，见图1。因2种增白剂结构相近，故在TLC中难以彼此完全分离。试验主要考察异丙醇-氨水-丙酮、异丙醇-氨水-乙酸乙酯、环己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、正丙醇-氨水、甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水和环己烷-乙酸乙酯等展开系统不同配比的展开效果，结果发现正丙醇-氨水（2∶2）与甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）2种展开剂分离效果较理想且斑点无拖尾现象，但正丙醇-氨水（2∶2）展开速度较慢，故选择甲醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水（0.6∶3.4∶0.5∶0.5）为最佳展开剂。如图2所示，因每个荧光增白剂出现2个色谱斑点，上侧第一个斑点较大，为主成分目标组分斑点，故应以比移值（Rf）相对较大的斑点作为主斑点，即判定斑点。C.I.71与C.I.113比移值分别为0.44和0.36。

图2 C.I.71和C.I.113分离度TLC图

2.2 模拟阳性样品检测

分别用定量毛细管吸取C.I.71和C.I.113对照品溶液、阴性样品溶液及模拟阳性样品溶液各4 μL，点于同一硅胶60F254铝板上，将展开后的目标斑点按1.3的试验方法进行测定。结果如图3及图4所示。TLC结果显示，阴性样品（-）在254 nm下虽有荧光猝灭斑点，但在365 nm下的对照品Rf附近并无任何荧光斑点，说明一次性纸杯基质对C.I.71和C.I.113的TLC检测无干扰；在模拟阳性样品（+）中，人为添加的增白剂能与纸杯基质初步分离。分别检测与C.I.71和C.I.113主斑点Rf值相同处的模拟阳性样品主斑点及其相应Rf值处阴性样品的拉曼光谱，图3C（d）与图4C（d）显示，阴性样品无拉曼信号，模拟阳性样品中添加的增白剂成分与相应对照品的拉曼谱图基本一致，说明纸杯基质对其内含增白剂的检测结果无干扰。在C.I.71和C.I.113对照品粉末的拉曼光谱图3C（a）与图4C（a）中，1 240 cm-1与979 cm-1附近谱峰相对强度分别与TLC原位富集对照品图3C（b）、4C（b）的谱峰相对强度不同，这可能由于组分经TLC展开富集，组分与展开剂及富集所用溶剂之间的分子间作用力所致，但不影响对相应组分的鉴别。谱图各特征峰归属见表1。

图3 C.I.71模拟阳性样品TLC图（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光谱图（C）

图4 C.I.113模拟阳性样品TLC图（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光谱图（C）

表1 拉曼图谱解析

2.3 检测限考察

分别用定量毛细管吸取1，2，3，4，6和8 μL C.I.71和C.I.113对照品溶液，点于同一硅胶60F254薄层板上，使对照品沉积量分别为5，10，15，20，30和40 ng，按1.3的试验方法进行测定，结果如图5及图6所示。分析方法的检测限（LOD）由信噪比（S/N=3）确定，C.I.71和C.I.113的检测限分别为5和15 ng。参照1.2的样品溶液的制备方法，可换算成一次性纸杯中C.I.71和C.I.113的检测限，分别为1.25和3.75 mg/kg，小于GB 4806.8—2016《食品安全国家标准 食品接触材料纸板材料及制品》10 mg/kg的检测要求。

图5 C.I.71 LOD的TLC图（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光谱图（C）

图6 C.I.113 LOD的TLC图（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光谱图（C）

2.4 真实样品检测

用定量毛细管吸取C.I.71和C.I.113对照品溶液和随机抽取的7批样品溶液各4 μL，点于同一硅胶60F254铝板上，按1.3的试验方法进行测定。结果如图7所示，7批样品均未检出C.I.71荧光斑点；在图8（B）中，与C.I.113对照品Rf值相近处有2批样品（1号和7号）出现相似的荧光斑点，为避免TLC出现假阳性结果，利用micro-Raman进一步确认，图8（C）显示1号和7号样品TLC原位富集micro-Raman光谱图与C.I.113对照品TLC原位富集micro-Raman光谱图峰形、峰位均一致，由此可进一步确认1号和7号样品中含有C.I.113。

图7 C.I.71样品TLC图

图8 C.I.113样品TLC图（A，254 nm；B，365 nm）及micro-Raman光谱图（C）

3 讨论与结论

显微拉曼光谱检测时，根据现有条件激发光源波长可选择532 nm和780 nm。试验发现，使用780 nm检测得到的峰强度较弱，达不到检测目的。根据拉曼散射效应与激发光频率的4次方呈正比（与波长的4次方呈反比）这一原理得出，激发光频率越大（波长越小），激发效果越明显，所以改用532 nm激发光源后，得到的峰强度增强，检测限变小，效果较好。

荧光共生是拉曼光谱分析的一个重要干扰。拉曼光和荧光都经由激发光激发产生，荧光强度通常比拉曼光强度高出若干数量级，而且激发波长越短荧光强度越大[16]。试验中2个组分均能产生较弱荧光信号，为避免荧光干扰，采取全自动基线校正的方式进行扣除。

试验建立TLC原位富集与显微拉曼光谱联用方法检测食品包装材料是否非法添加荧光增白剂，结果在7批市售一次性纸杯中检测出有2批添加了荧光增白剂113。该方法专属性强、灵敏度高，可为食品包装材料中荧光增白剂的检测提供备选方法。