细胞裂解蛋白研究进展

杨宝贞，卢 杰，刘梦倩，闫洪波

(河北经贸大学，河北 石家庄 050000)

0 引言

从细胞中回收细胞内分离目的产物通常采用物理破碎细胞方法，这将产生许多大小不均一的细胞碎片，影响回收效率。同时，由于剪切的机械作用力，也可能导致部分大分子变性。解决这个问题的办法是利用具有自溶能力细菌作为生产菌，将其置于外部环境因素(如温度或化学诱导)的控制下进行裂解。噬菌体或大肠杆菌素系统裂解酶可以使细菌细胞在温和、可控条件下进行有效裂解细胞[1]。

噬菌体裂解酶是在感染细菌后期表达的一类细胞壁水解酶，能够水解细菌细胞壁中的肽聚糖从而杀灭细菌，这种裂解酶对细菌的细胞壁具有极强的特异性和高效性，目前已开展了广泛研究。

绝大多数的双链DNA噬菌体采用经典的“穿孔素-内溶素”裂解系统，该系统主要由噬菌体编码的穿孔素和内溶素两类蛋白组成[2-3]。裂解酶在噬菌体感染宿主后期合成，存在于胞质中，穿孔素在细胞膜上形成低聚物，对细胞膜进行穿孔，改变宿主细菌细胞膜的通透性，穿过细胞膜孔洞，与细胞壁上的肽聚糖靶点结合，破坏其肽聚糖层，二者依次发挥作用，使子代噬菌体释放到胞外。

动植物中也有类似裂解蛋白的物质，其作用机制大致相同。动物裂解细胞膜有传统的促凋亡蛋白BAX和BAK及邵峰院士新发现的炎症性半胱氨酸蛋白酶。植物裂解细胞则有植物抗菌肽等。

1 类型

1.1 噬菌体裂解蛋白

1.1.1 λ噬菌体

λ噬菌体能迅速裂解受感染的宿主细胞。在λ感染的大肠杆菌S、R和Rz中，有三个噬菌体基因产物是细胞死亡所必需的。基因产物R和Rz被认为降解宿主细胞壁，而基因产物S似乎负责改变细胞膜，从而允许基因产物R和Rz到达细胞壁层。R基因产物被鉴定为反式糖基化酶，而Rz基因产物可能是内肽酶。基因产物S在生产时主要定位于内膜[1]。

含有S、R和Rz基因的裂解区已经被克隆并置于IAC启动子的控制下。用诱导剂异丙基-3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子，可在诱导后40 min内迅速裂解。已确定S和R基因产物都是通过克隆的裂解基因进行裂解所必需的，基因产物Rz只在含有高浓度Mg2+的培养基中裂解是必需的。所有关于λ噬菌体裂解的信息都包含在它的裂解区域内，一旦确定了裂解的决定，就没有发现影响裂解的大肠杆菌基因。

1.1.2 T4噬菌体

在噬菌体T4和λ的裂解基因之间发现了几个相似之处。噬菌体T4的裂解需要两个基因产物的作用e和t。e基因编码一种溶菌酶被鉴定为溶菌酶，而t基因似乎具有与lambda S基因相似的功能，它是裂解所必需的，但似乎不具有溶菌酶活性。噬菌体是由t-突变体形成的，但大肠杆菌宿主的裂解不会发生，除非添加氯仿。基因t是在裂解过程中停止细胞新陈代谢所必需的，它会降解或改变细胞膜，从而使基因产物e到达周质并进入细胞壁。T4溶菌酶基因e仅在TACH启动子的控制下被克隆。

影响噬菌体T4裂解的大肠杆菌突变体已经被分离出来，这些突变体在肽聚糖的合成中受到损害，并且已经被证明可以在e-T4噬菌体中裂解和释放噬菌体。这些突变体对抗生素、洗涤剂和一些黏菌素也有更高的敏感度。此外，它们还映射到大肠杆菌染色体的Thr-Ara-Ieu区域，该区域编码许多参与细胞分裂的基因，因此大肠杆菌宿主功能似乎影响噬菌体T4的裂解。

1.1.3 phiX174噬菌体

噬菌体phiX174是一种小的单链DNA噬菌体，是丝状噬菌体科代表种，其中phi表示这类噬菌体对这几类细菌有害作用，X代表抗原，174是编号[4]，已知能在感染后20～25 min内使受感染的细胞裂解。PhiX174基因E是宿主细胞裂解所必需的。基因E蛋白的分子量为10 000道尔顿，由91个氨基酸组成。核苷酸序列表明，基因产物E是疏水性的，与细胞膜相互作用，所以基因产物E可能具有膜相关功能。

PhiX174基因E置于lac启动子的控制下，通过添加诱导剂IPTG诱导宿主细胞裂解，诱导后完成裂解的时间间隔因宿主细胞不同而不同，在成熟的噬菌体或感染的细胞中没有发现裂解活性。

细菌菌蜕(bacetiral ghosst，BG)是通过基因灭活的方法即噬菌体phi X174的裂解蛋白E在革兰氏阴性(G-)菌细胞膜形成一个直径40～90 nm跨膜孔道结构，在渗透压的作用下使G-菌的胞质内容由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳[5]。菌蜕疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫两种免疫方式，同时菌蜕疫苗保留了完整的细菌表面结构，不导致抗原结构的变化。

通常将E特异性跨膜孔道的形成过程分为3个阶段：整合阶段、穿膜阶段、膜融合阶段。目前，菌蜕在疫苗制备方面广泛应用于胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、新城疫病毒菌等，作为递送药物、核酸的载体[5]。

1.1.4 MS2噬菌体

噬菌体MS2是一种单链RNA噬菌体，含有足以裂解的单个裂解基因。当将裂解基因L置于LPL启动子或Lac启动子的控制下时，在诱导后40～60 min内引起宿主细胞的裂解。

MS2的裂解诱导机制尚未完全逆转。有人认为，即使在诱导基因L后，标记的细胞壁的降解没有增加，但裂解是通过触发自溶酶进行的，这与青霉素诱导的自溶相似，但在pH5.0时不会发生基因L的裂解。在诱导裂解时，细胞的通透性增加，这取决于底物邻硝基苯基-[β-D-半乳糖苷(ONPG)渗透到细胞颗粒中以检测可测量的[β-半乳糖苷酶]的能力。

Goessens[1]等人表明，L基因的裂解活性位于该蛋白的C-末端，构建了含有该蛋白末端25个氨基酸的合成肽。研究发现，该肽可能通过在膜上形成亲水孔来消散质子动力。

1.1.5 Qβ噬菌体

在噬菌体Qβ中，成熟蛋白A2已被证明是唯一的裂解所必需的基因产物。该裂解基因是在lac启动子控制下克隆的，诱导30 min内即可裂解。裂解的机制还没有完全被发现，但裂解受细胞内蛋白A2浓度的调节。A2蛋白与MS2裂解基因产物L或phiX174裂解基因产物E没有同源性。

1.1.6 内溶素

内溶素是噬菌体编码的一种蛋白，具有溶解细胞壁的作用，释放毒力因子，它不同于噬菌体编码的其他裂解酶。其他裂解酶是穿透局部细胞壁并让噬菌体基因组进入细胞内。某些内溶素在溶解细胞壁时，还需要Holin蛋白的协助。Holin蛋白是一种疏水性跨膜蛋白，它可以在细胞膜上形成非特异性的孔洞，促使细胞裂解[6]。

1.1.7 基于细菌 T6SS 的裂解系统

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是革兰氏阴性细菌的一种独特分泌方式[7]。T6SS 是一种类似 T4 噬菌体尖状尾部的细胞穿刺装置，它通过接触-依赖的方式刺入到受体细胞内并释放相应的效应蛋白而发挥作用[8-9]。T6SS是一种纳米收缩鞘装置，它由跨膜复合物、基底和鞘、管复合体三部分组成[10-11]。具有 T6SS 装置的细菌通过直接接触宿主细胞或者竞争菌将收缩鞘装置刺入受体细胞内，进而释放相应的效应因子，对受体细胞造成损伤[12-14]。

1.2 动物裂解蛋白

动物促凋亡蛋白BAX和BAK似乎是功能性穿孔素，可能来自细菌穿孔素，也可能不来自细菌穿孔素。作为对凋亡信号的响应，动物细胞的线粒体经历了外膜通透性，这允许细胞色素和其他线粒体蛋白释放到胞浆中，启动一系列蛋白水解事件，即“caspase级联”。线粒体通透性受Bcl-2家族蛋白的调控，包括Bcl-2、Bcl-xLAS等抗凋亡蛋白和Bax、Bak等促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白通过抑制促凋亡蛋白Bcl-2家族的功能而明显抑制通透性，因此抗凋亡蛋白在功能上类似于抗凋亡蛋白，而促凋亡蛋白类似于穿孔素蛋白。在凋亡过程中，Bax或Bak被激活，在线粒体膜外膜形成同源低聚物，然后形成孔。

邵峰等人[15]通过caspase-11和caspase-1介导的小鼠骨髓巨噬细胞嗜热症的全基因组群集规则间隔回文重复(CRISPR)-Cas9核酸酶筛选来鉴定Gasdermin D(Gsdmd)，GSDMD缺陷细胞抵抗胞浆内脂多糖和已知的典型炎性小体配体诱导的细胞凋亡。

炎症性半胱氨酸蛋白酶(caspase-1、-4、-5和-11)对天然防御至关重要。Caspase-1和caspase-4/5/11特异性地切割了GSDMD氨基末端Gasdermin-N和羧基末端Gasdermin-C结构域之间的连接子，这是发生细胞凋亡所必需的。Caspase-1被各种典型炎性小体的配体激活，caspase-4、-5和-11直接识别细菌脂多糖，均可引发细胞凋亡。

同时，裂解释放了对Gasdermin-N结构域的分子内抑制作用，显示出内在的松弛诱导活性。Gasdermin家族的其他成员没有被炎症性半胱氨酸蛋白酶切割，但具有自我抑制作用，导致脱发和皮肤缺陷的Gsdma3功能获得性突变破坏了自抑制作用，从而使其gasdermin-N结构域触发了细胞凋亡。这些发现提供了对炎性小体介导的免疫的洞察力，也改变了人们对细胞凋亡和程序性坏死的理解。

1.3 植物裂解蛋白

植物抗菌肽(AMPs)通常富含半胱氨酸残基，形成多种二硫化物[16-17]。反过来，二硫化物以富含胱氨酸的多肽的形式交叉支撑植物AMP，使它们具有极高的化学、热稳定性和蛋白水解稳定性。富含半胱氨酸或俗称富半胱氨酸肽(CRP)的植物AMPs根据其序列相似性决定其独特的二硫键模式的半胱氨酸基序和三级结构折叠被划分为几个家族。富含胱氨酸的植物腺苷酸家族包括硫蛋白、防御素、橡胶蛋白、knottins(线型和环型)、脂转移蛋白、α-发夹蛋白和snakins家族，如表1所示。此外，还有富含其他氨基酸的AMPs。植物AMP组织具有保守结构折叠的特定家族的能力，这使得包裹在特定家族内同一支架中的非半胱氨酸残基的序列变异能够发挥多种功能。植物AMP利用保守的支架耐受高可变序列的能力提供了多样性，通过改变非半胱氨酸残基的序列来识别不同的靶标，这些特性为开发植物AMPs作为潜在的治疗药物和通过转基因方法保护作物提供了良好的前景。

表1 植物抗菌肽的分类Tab.1 Classification of botany antimicrobial peptide

2 应用

噬菌体裂解酶对细菌的裂解能力使其具有多种潜在的应用前景，这些应用范围从食品保存到病原体检测，最终要么利用溶酶的肽聚糖水解作用，要么利用其(CWBD)结合功能来实现其最终目标。各类裂解蛋白及优势如表2所示。

表2 裂解蛋白的应用及优势Tab.2 Application and advantages of lytic protein

在食品生物保鲜方面，噬菌体裂解酶在控制食源性致病菌方面具有防腐作用。致病菌对个人特别是老年人及免疫功能受损的人的健康构成了重大威胁。

在医学治疗方面，溶菌技术代表了控制各种动物和人类感染病原菌的另一种治疗方法。使用裂解系统预防细菌感染比抗生素和化学抑菌剂或杀菌剂更有优势，因其对各自的生物体都有很高的特异性，这在治疗链球菌、葡萄球菌、肠球菌和杆菌等不能用传统方法治疗的耐药病原性细菌感染方面可能特别有价值。

噬菌体裂解酶用于治疗的发展趋势在抗生素逐渐对耐药菌株失效的困境下，可以筛选耐药菌的噬菌体， 并将其产生的裂解酶单独用药或和抗生素等其他抗菌药物一起联合用药，这扩大了裂解酶的广谱性，又避免了靶细胞的耐药性。另外，可以通过分子生物学方法改造噬菌体裂解酶，扩大其宿主谱，使其能够特异性裂解某一种属的细菌，甚至不同种属的细菌[18]。

噬菌体还可以用于检测细菌。世界上医学和公共卫生组织有必要建立一个快速、特异、敏感的方法来检测致病菌细菌。基于抗体检测方法是敏感的，但耗时和费力，PCR方法的敏感性提高，可成本昂贵，操作技术很困难，噬菌体具有严格的宿主特异性，能坚持一种微粒细菌，甚至某一株细菌，可以使用噬菌体途径，提供了方便、快速、高度特定的选择，成本相对较低。同时，对生物膜的清除方面也有作用，许多致病菌的一个重要特征是它们能够形成生物被膜，导致它们对许多抗菌剂94、95具有耐受性，而裂解酶具有消除这些结构的潜力。