糖对椰枣组织培养物的影响

李东霞 徐中亮 符海泉 张宁 王义 王富有

摘要：【目的】為降低椰枣愈伤组织褐化率和提高体胚发生率，研究培养基中不同糖处理对愈伤组织和体胚发生的影响，为优化培养基配方提供依据。【方法】以椰枣组织培养物为研究对象，进行3种糖处理（蔗糖、蔗糖+果糖、蔗糖+葡萄糖）的组织培养试验，统计椰枣愈伤组织褐化率及体胚发生率，测定不同糖处理下愈伤组织、体胚和不定芽的淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖含量，综合分析不同糖处理对椰枣组织培养物影响的差异。【结果】在蔗糖培养基中增加果糖，体胚和不定芽的蔗糖含量和葡萄糖含量下降，愈伤组织和体胚的果糖含量及愈伤组织的淀粉含量上升，愈伤组织褐化率升高。在蔗糖培养基中增加葡萄糖，不定芽蔗糖含量和愈伤组织果糖含量降低，愈伤、体胚和不定芽的淀粉含量上升，愈伤和体胚的葡萄糖含量上升，体胚发生率升高。愈伤组织和体胚的淀粉和果糖含量显著高于不定芽的淀粉和果糖含量（P<0.05，下同），愈伤组织的葡萄糖含量显著高于体胚和不定芽，体胚的蔗糖含量显著高于不定芽，不定芽的蔗糖含量显著高于愈伤组织。相关分析结果表明：愈伤组织褐化率与愈伤组织果糖含量、不定芽果糖含量均呈显著正相关;体胚发生率与体胚淀粉含量呈显著正相关;体胚发生率与体胚蔗糖含量、愈伤组织褐化率与愈伤组织果糖含量均呈极显著正相关（P<0.01，下同）;体胚发生率与体胚蔗糖含量、愈伤组织葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量均呈极显著正相关，同时，与体胚淀粉含量呈显著正相关。【结论】在椰枣愈伤组织诱导与增殖培养过程中减少果糖的用量，在体胚发生培养时增加葡萄糖的用量，可降低愈伤组织的褐化率，提高体胚发生率。

关键词：椰枣;组织培养物;蔗糖;果糖;葡萄糖

中图分类号：S667.904.3                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）11-3059-08

Effects of sugar on tissue culture of date palm

LI Dong-xia， XU Zhong-liang， FU Hai-quan， ZHANG Ning， WANG Yi， WANG Fu-you*

（Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops/Tropical Palm Germplasm Nursery， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Wenchang， Hainan  571339， China）

Abstract：【Objective】In order to reduce the callus browning rate and increase somatic embryogenesis rate， and provide the basis for the optimizing medium formulation， this experiment was conducted to study the effect of the ratio of sucrose， fructose and glucose in the culture medium on the callus and somatic embryos during tissue culture of date palm.【Method】The cultures were used as research object. Three treatments（sucrose， sucrose+fructose， sucrose+glucose） were used to the tissue culture experiment. The callus browning rate and somatic embryogenesis rate were observed and analyzed. The content of starch， sucrose， fructose and glucose in callus， somatic embryo and adventitious bud were detected and analyzed. Comprehensive analysis of the difference of different sugar treatments on the tissue culture of date palm.【Result】Increasing fructose in the sucrose culture medium decreased the sucrose content of somatic embryos and adventitious buds， and the glucose content， while increased the fructose content of callus and somatic embryos and the starch content of callus， and increased the callus browning rate. Increasing glucose in the sucrose medium decreased the sucrose and fructose content of adventitious buds， while increased the starch content of callus， somatic embryos and adventitious buds， increased the glucose content of callus and somatic embryos， and increased somatic embryogenesis rate. The starch and sugar content of callus and somatic embryos were significantly higher than that of the starch and sugar content of adventitious bud（P<0.05， the same below）. The glucose content of callus was significantly higher than that of the glucose content of somatic embryos and adventitious bud. The sucrose content of somatic embryos  was significantly higher than that of the sucrose content of adventitious bud， the sucrose content of adventitious bud was significantly higher than that of the sucrose content of callus. The results of correlation analysis showed that the callus browning rate was extremely significantly positively correlated with the fructose callus（P<0.01， the same below）. The somatic embryogenesis rate was extremely significantly positively correlated with sucrose content of somatic embryos， glucose content of callus and somatic embryos， and it was significantly positively correlated with the the starch content of somatic embryos. 【Conclusion】It is necessary to reduce the fructose in the the medium for callus induction and proliferation， and add glucose in the medium for somatic embryogenesis during date palm tissue culture， thereby decrease the callus browning rate and increase the somatic embryogenesis rate.

Key words： date palm; tissue culture; sucrose; fructose; glucose

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN325）; Agricultural International Exchange and Coo-peration Project（125163015000200006）; Protection Project of Species Resources（125163015000160004）

0 引言

【研究意义】椰枣（Phoenix dactylifera L.）是中东和北非地区重要的木本粮食作物，为多年生热带棕榈植物，雌雄异株，繁殖方式多依赖植物组织培养方法（李东霞等，2017，2019;Gantait et al.，2018）。在植物组织培养基中通常需要加入糖作为碳源来维持外植体的生长（伍菲，2008），培养基中添加的糖的种类和用量不仅影响培养物的生长速度、生长量、代谢水平及次生代谢物合成，还影响细胞的分化和形态发生（吉训志等，2019b）。糖和生物大分子的代谢对植物体胚发生有着重要影响（崔丽娜等，2011;Baskaran et al.，2016）。植物组织培养中碳源的种类及其浓度的选择是必不可少的环节。因此，研究不同糖对椰枣组织培养物的影响，对进一步优化椰枣愈伤组织诱导和体胚发生培养基配方，降低愈伤组织褐化率，提高体胚发生率具有重要意义。【前人研究进展】国外研究者多针对椰枣不同品种和组织部位改变培养基中蔗糖浓度（Gantait et al.，2018），以Zaghlool茎尖为外植体时，在体胚发生培养中添加2%～3%的蔗糖，能够使组织培养物在5 ℃避光保存12个月（Bekheet et al.，2002）;以Medzool、Sayar、Samran和Jaglool茎尖为外植体时，在愈伤诱导和体胚发生培养中添加3%的蔗糖，有利于通过体细胞胚胎发生途径获得克隆苗，其中从基因型Sayar获得的80多个克隆已经转移到田间进行农艺评价（Bhargava et al.，2003）;以Sukary茎尖为外植体时，在体系胞胚胎发生过程中培养基分别设计添加0、3%和6%的蔗糖与5% PEG-8000的组合，发现培养基中添加6%的蔗糖和5% PEG-8000大大提高了体胚产量（Alkhateeb，2006）;以Sakoty嫩叶为外植体时，在体胚发生培养基中添加4%的蔗糖，能直接诱导嫩叶形成体胚及发育成苗，而以老叶为外植体时无法直接诱导形成体胚（Elbar and Eldawayati，2014），可见并未开展通过改变添加培养基中不同糖种类组合获得更好的效果的研究。国内有研究发现蔗糖、果糖、葡萄糖、淀粉与多年生植物体胚发生密切相关，赖钟雄和李惠华（2006）研究发现龙眼体胚发生过程中出现2次淀粉积累高峰期;顾晓川等（2018）研究发现在橡胶体细胞胚植株再生培养基中蔗糖的最佳用量为50 g/L;吉训志等（2019a）研究认为蔗糖含量的积累是荔枝体胚发生的前提，随着荔枝体胚发生进一步分化，蔗糖含量下降，果糖和葡萄糖含量上升，同时淀粉含量与荔枝体胚发生密切相关;吉训志等（2020）研究发现在胡椒的胚性愈伤组织时期，其果糖和葡萄糖含量最高，表现出胚性愈伤组织极强的分化能力。【本研究切入点】目前国内外鲜见研究不同糖种类对椰枣组织培养物影响的报道。【拟解决的关键问题】采用固体培养的试验，分析蔗糖、蔗糖+果糖及蔗糖+葡萄糖3种糖处理中椰枣的愈伤褐化率和体胚发生率，以及培养物中不同糖类含量的差异，探讨糖对椰枣组织培养物的影响，为优化椰枣组织培养提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以椰枣fard无菌苗的不定根根尖培养形成的愈伤组织、体细胞胚胎和不定芽为试验材料。其中椰枣无菌苗的培养方法：去掉椰枣种子表皮，将椰枣种子的两端剪掉，将灭菌洗涤好的种子接种于MS+3 g/L活性炭（200目）+3.5 g/L植物凝胶+30 g/L蔗糖的培养基上，培养环境为全黑暗培养，培养温度为（26±1）℃。以培养30 d后的椰枣无菌苗的带有不定根的主根为外植体，将其接种于培养基中进行培养，获得椰枣愈伤组织、体胚和不定芽。

1. 2 培养条件

于2020年12月挑选长势一致的愈伤组织接种于培养基中，每盒培养基接种9块愈伤组织，同时挑选长势一致的体胚和白色不定芽接种于培养基中，每盒培养基均分别接种9块体细胞胚胎和不定芽，培养环境均为全黑暗培养，培养温度为（26±1）℃。本试验所有材料进行不同糖处理的培养基为MS+2 mg/L异戊烯基腺嘌呤（2ip）+2 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+1 mg/L萘乙酸（NAA）+5 mg/L谷氨酰胺（Gln）+10 mg /L酸水解酪蛋白+3.5 g/L植物凝胶+糖，设置不同的糖处理CK、M1和M2处理（表1）。滅菌前培养基pH 5.70～5.75。椰枣组织培养物的培养均在中国热带农业科学院椰子研究所组织培养暗培养室中进行，培养环境为全黑暗培养，培养温度为（26±1）℃。每45 d继代培养1次。

1. 3 测定指标及方法

采用华为P30手机超级微距拍摄不同糖处理20 d后椰枣愈伤组织的形态变化。用万分之一电子天平称取样品液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。采用索莱宝葡萄糖含量检测试剂盒（BC2500可见分光光度法）测定葡萄糖含量（Basagni and Bonicolini，1991）;采用索莱宝淀粉含量检测试剂盒（BC0700蒽酮比色法）测定淀粉含量（Rose et al.，1991）;采用索莱宝果糖含量检测试剂盒（BC2450可见分光光度法）测定果糖含量（Varandas et al.，2004）;采用索莱宝蔗糖含量检测试剂盒（BC2460可见分光光度法）测定蔗糖含量（Fils-Lycaon et al.，2011）。以上测定具体方法均参照制造商说明书进行测定，按照样本质量进行计算，每个指标的测定进行3次生物学重复。

1. 4 统计分析

采用Excel 2010对试验数据进行分析并制图;采用SAS 9.1进行方差分析;采用OriginPro 9.1进行变异情况分析和相关分析。

2 结果与分析

2. 1 糖对椰枣愈伤组织褐化率和体胚发生率的影响

将培养相同时期的愈伤组织接入到不同糖处理的培养基中，在接种20 d后观察椰枣愈伤组织的褐化情况，发现愈伤组织在M1处理下比在CK和M2处理下褐化更明显（图1），褐化率显著增加（P<0.05，下同），分别是CK和M2处理下愈伤组织褐化率的3.51和4.10倍，M2处理的愈伤组织褐化率与CK间无显著性差异（P>0.05，下同）;相同时期的胚性愈伤组织接入到M2处理培养基中其体胚发生率增加，分别是CK和M1处理下体胚发生率的2.55和6.42倍（表2）。

2. 2 糖对椰枣组织培养物淀粉含量的影响

从图2可看出，3个处理下不定芽的淀粉含量均显著低于愈伤组织和体胚，愈伤组织与体胚间淀粉含量无显著性差异;M2处理下愈伤组织淀粉含量显著高于CK，是CK的愈伤组织淀粉含量的1.25倍，同时，M2处理下体胚淀粉含量显著高于CK和M1处理，分别是CK和M1处理下体胚淀粉含量的1.23和1.13倍，M2处理下不定芽淀粉含量也显著高于CK和M1，分别是CK和M1处理下不定芽淀粉含量的1.38和1.80倍。

2. 3 糖对椰枣组织培养物蔗糖含量的影响

从图3可看出，3个处理下愈伤组织的蔗糖含量最低，显著低于不定芽和体胚，不定芽的蔗糖含量显著低于体胚。同时，3个处理间愈伤组织蔗糖含量无显著性差异;M1处理下体胚蔗糖含量显著低于CK和M2处理，分别是CK和M2处理下体胚蔗糖含量的81%和79%;M1和M2处理下不定芽蔗糖含量显著低于CK，分别是CK的体胚蔗糖含量的79%和82%。

2. 4 糖对椰枣组织培养物果糖含量的影响

从图4可看出，不同糖处理下椰枣不同培养阶段培养物的果糖含量不同，3个处理下不定芽的果糖含量均显著低于愈伤组织和体胚。M1处理下愈伤组织和体胚果糖含量显著高于CK和M2处理，其中，M1处理下愈伤组织果糖含量分别是CK和M2处理的1.19和1.71倍，其体胚果糖含量分别是CK和M2处理下体胚果糖含量的1.66和1.21倍。M2处理下愈伤组织果糖含量显著低于CK，是CK愈伤组织果糖含量的70%;M2处理下体胚果糖含量显著高于CK，是CK体胚果糖含量的1.37倍。

2. 5 糖对椰枣组织培养物葡萄糖含量的影响

从图5可看出，3个处理下愈伤组织的葡萄糖含量均显著高于不定芽和体胚。M2处理下愈伤组织和体胚葡萄糖含量均显著高于CK和M1处理，其中，M2处理下愈伤组织葡萄糖含量分别是CK和M1处理的1.38和1.45倍，其体胚葡萄糖含量分别是CK和M1处理的1.49和1.98倍;M2处理下不定芽葡萄糖含量显著高于M1处理，是M1处理下不定芽葡萄糖含量的1.75倍。

2. 6 糖对椰枣组织培养物生理指标变异系数的影响

不同糖处理下，椰枣不同阶段组织培养物的14个生理指标中愈伤组织褐化率和体胚发生率的四分位距大，落在箱子里的范围分散，数据波动幅度大，变异系数大，达70.00%以上。不定芽葡萄糖、体胚葡萄糖、体胚果糖、不定芽淀粉、愈伤组织果糖和愈伤组织葡萄糖含量的四分位距较愈伤组织褐化率和体胚发生率小，变异系数范围在19.02%～31.67%;愈伤组织蔗糖、体胚淀粉和愈伤组织淀粉含量的四分位距小，落在箱子里面的数据集中，数据波动幅度小，变异系数范围在10.68%～12.00%;体胚蔗糖含量的变异系数是11.84%，四分位居虽比较大，但数据近似对称，中位数近似位于四分位居的中间，不存在异常值（图6，表3）。

2. 7 不同糖处理下椰枣不同组织培养物性状的相关分析

如表4所示，不同糖处理下，体胚发生率与体胚蔗糖含量、愈伤组织葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量，愈伤组织褐化率与愈伤组织果糖含量，体胚蔗糖含量与愈伤组织葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量，不定芽蔗糖含量与不定芽葡萄糖含量，以及愈伤组织葡萄糖含量与体胚葡萄糖含量均呈极显著正相关（P<0.01，下同）;不定芽果糖含量与愈伤组织褐化率、愈伤组织果糖含量，体胚发生率与体胚淀粉含量，不定芽淀粉含量与愈伤组织葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量，均呈显著正相关。愈伤组织褐化率与体胚蔗糖含量、不定芽葡萄糖含量，体胚发生率与愈伤组织果糖含量、不定芽果糖含量，不定芽淀粉含量与愈伤组织果糖含量，体胚蔗糖含量与愈伤组织果糖含量、不定芽果糖含量，不定芽蔗糖含量与体胚果糖含量，以及愈伤组织果糖含量与愈伤组织葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量，体胚果糖含量与不定芽葡萄糖含量均呈极显著负相关。愈伤组织褐化率与体胚发生率、不定芽蔗糖含量和体胚葡萄糖含量，愈伤组织淀粉含量与不定芽蔗糖含量，愈伤组织蔗糖含量与体胚果糖含量，以及不定芽果糖含量与愈伤组织葡萄糖含量和体胚葡萄糖含量均呈显著负相关。

3 讨论

碳水化合物在体外培养方面起重要作用，发挥着营养和调控效应。糖类在常绿果树体胚发生过程中既是一种渗透剂，又是一种能源和碳源，使用浓度常为3%（Encina et al.，2014）。蔗糖是植物组织培养中普遍添加的碳源，是决定培养物生长速度、生长量、代谢水平及次生代谢物合成的关键因素之一（李秋利等，2019;Ameri et al.，2020）。本研究中，蔗糖+果糖处理下提高了椰枣愈伤组织的褐化率;蔗糖+葡萄糖处理下提高了椰枣体胚发生率，可见改变培养基中糖的添加量和种类也使椰枣组织培养物的代谢水平和形态发生变化，从而影响椰枣愈伤组织褐化率和体胚发生率。阮燕晔等（2007）研究发现拟南芥愈伤组织可吸收蔗糖，蔗糖转化酶将蔗糖的分解产生为果糖和葡萄糖供于愈伤组织吸收，且其吸收葡萄糖的能力高于果糖。孙果忠等（2009）的研究报道也证实了这一点，其研究发现葡萄糖能促进小麦未成熟胚、休眠成熟胚及不休眠成熟胚的萌发。本研究中，椰枣体胚发生率与愈伤葡萄糖含量、体胚葡萄糖含量呈极显著正相关，葡萄糖有助于体胚的形成，與前人研究结果相同，即提高培养基中葡萄糖含量有益于愈伤组织和体胚的发育。综上所述，相比蔗糖和果糖，葡萄糖更有利于椰枣体胚发生。

淀粉是常绿果树能源贮存物质，淀粉积累与常绿果树体胚发生密切相关（司园园等，2018），龙眼体胚发生过程中出现2次淀粉累积高峰值，分别为愈伤组织形成阶段和球形胚阶段，在其体胚发生早期的胚性愈伤组织阶段淀粉含量有累积高峰，而在体胚发生过程中逐渐减少，消耗的淀粉含量为其他物质的合成提供了物质能量（赖钟雄和李惠华，2006）。淀粉含量与荔枝体胚发生也密切相关（吉训志等，2019a）。本研究中椰枣愈伤组织和体胚的淀粉含量显著高于不定芽，同时发现椰枣体胚发生率与体胚淀粉含量呈显著正相关。

吉训志等（2019a）研究认为荔枝体胚发生的前提必须有蔗糖含量的积累，但是随着体胚发生的进一步分化，果糖和葡萄糖以碳骨架物质参与体胚结构的发育，因而蔗糖含量下降、果糖和葡萄糖含量上升。吉训志等（2020）研究发现糖类、生物大分子与胡椒体细胞胚胎发生密切相关，胡椒愈伤组织中蔗糖含量显著低于体细胞胚胎和体细胞胚胎增殖时期的蔗糖含量，胚性愈伤组织的的葡萄糖含量显著高于体细胞胚胎。本研究也有类似发现，3种糖处理下椰枣愈伤组织的蔗糖含量最低，显著低于不定芽的蔗糖含量，而不定芽的蔗糖含量显著低于体胚，愈伤组织中葡萄糖含量最高，显著高于体胚和不定芽的葡萄糖含量，但是在蔗糖+果糖处理下，体胚的蔗糖和葡萄糖含量显著低于蔗糖和蔗糖+葡萄糖处理;愈伤组织与体胚的果糖含量没有显著性差异，且均显著高于其他2个处理下愈伤组织和体胚的果糖含量。王瑞等（2013）对比分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖、和麦芽糖等5种碳源對油茶愈伤组织诱导的影响，结果发现在30g/L的果糖处理下，油茶愈伤组织的诱导率最低。本研究发现，在蔗糖+果糖处理下椰枣愈伤组织褐化率最高，同时相关分析表明愈伤组织褐化率与愈伤组织果糖含量呈极显著正相关，可见培养基中果糖含量不利于愈伤组织的发育，如需降低椰枣愈伤组织的褐化率，则应减少培养基中果糖含量。

4 结论

在椰枣愈伤组织诱导与增殖培养过程中减少果糖的用量，在体胚发生培养时增加葡萄糖的用量，可降低愈伤组织褐化率，提高体胚发生率。

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收稿日期：2021-05-07

基金項目：海南省自然科学基金项目（319QN325）;农业国际交流与合作项目（125163015000200006）;物种品种资源保护费项目（125163015000160004）

通讯作者：王富有（1970-），https：//orcid.org/0000-0002-8671-210X，研究员，主要从事植物遗传资源政策和农业科技发展战略研究工作，E-mail：fuyouwangcatas@163.com

第一作者：李东霞（1987-），https：//orcid.org/0000-0003-4238-1932，主要从事椰枣组织培养与营养研究工作，E-mail：lixia.311@163.com