复方气管炎片微生物限度检查方法适用性研究

闵 朕，卫延明，杜思迪

（陕西省渭南市食品药品检验所，陕西 渭南 714000）

中药饮片的微生物污染严重[1- 2]，微生物限度检查是保障其安全性的重要措施。微生物方法适用性的本质就是建立对样品影响更小、操作得率更高的方法[3]。去除药品的抑菌性是微生物限度检查方法适用性试验的重点和难点，也是避免出现假阴性结果的重要环节[4]。中药种类多，相互关系复杂[5]，清热药、泻下药等均具有抑菌性[6]，加之中西医抑菌药物联用具有抗菌增敏作用[7-8]，其抑菌作用较强，故建立具有抑菌性的中药制剂的微生物限度检查方法较困难。复方气管炎片临床多用于治疗急慢性支气管炎、咳嗽等症，具有中药和西药的多种抑菌成分，抑菌性强且不易去除，建立微生物限度检查方法难度较大。本研究中采取平皿法、稀释法、薄膜过滤法及多法联用的方式进行渐进式研究，建立了复方气管炎片的微生物限度检查方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与菌种

仪器：BS2202S 型电子天平（德国Sartorius 公司），PB-10 型pH 酸度计（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司）；VITEK2 Compact 型全自动微生物生化鉴定系统（法国BioMérieux 公司）；HFsafe-1200LC 型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；WJ-6 型无菌检查仪（天津市罗根科技有限公司）；OLYMPUS-CH 型显微镜（日本Olympus 公司）；涡旋混合器（德国IKA 公司）；FC752 型薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司）。

样品及培养基：复方气管炎片（陕西春晖药业有限公司，批号为190706，规格为每片0.35 g）；胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基、胰酪大豆胨液体（TSB）培养基、沙氏葡萄糖液体（SDB）培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基，均购自北京陆桥技术有限责任公司，适用性检查结果符合2015年版《中国药典（四部）》通则要求；pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液按2015年版《中国药典》要求配制和灭菌。

菌 种：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均来自中国医学细菌保藏管理中心，工作用菌株为新鲜制备的第3 代菌悬液。

1.2 方法

1.2.1 供试液制备

取样品10 g，精密称定，加入100 mL TSB 培养基中，45 ℃水浴恒温振摇15 min，混匀，静置15 min，制成1 ∶10 供试液；取50，20 mL，分别加入含50，80 mL TSB培养基无菌瓶中，混匀，制得1 ∶20，1 ∶50 供试液。

1.2.2 计数方法适用性试验

平皿法：试验组，取上述3 种供试液，分别装满5 个9.9 mL 无菌试管，再分别加入新鲜制备的含菌量不大于104cfu/mL 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液各0.1 mL。对照组，取制备好的1 ∶10 供试液9.9 mL，加入0.1 mL TSB 培养基。菌液组，取TSB 培养基分装于5 个9.9 mL 无菌试管，其后操作同试验组。分别取1 mL 供试液，置直径为90 mm 或150 mm 的无菌平皿中，加入不超过45 ℃的TSA 培养基或SDA 培养基约20 mL 或50 mL。待各平皿中的液体凝固后，分别按规定培养条件培养并计数。

薄膜过滤法：试验组，取1 ∶20 供试液1 mL，加入含100 mL pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液的输液瓶，薄膜过滤，用pH7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗3 次，每次100mL。在最后一次冲洗液中分别加入含菌量不大于100 cfu/mL的上述菌液1 mL。对照组，取制备好的1 ∶20 供试液1 mL，不加试验菌，其余操作同试验组。菌液组，除不加供试液外，其余操作同试验组。制备好的滤膜，菌面朝上贴于TSA 培养基上，按规定条件倒置培养，计数。

以上2 种方法中，各试验菌的回收率为试验组平均菌落数与对照组平均菌落数之差除以菌液组平均菌落数的值。若均为0.5 ～2.0，则判定方法通过。

1.2.3 控制菌检查方法适用性试验

试验组，分别取1 ∶10 供试液10 mL，分别接种至100，200，500 mL TSB 培养基中，同时分别加入含菌量不大于100 cfu/mL 的大肠埃希菌1 mL，混匀，35 ℃条件下培养18 h，取上述培养物1 mL，接种至100 mL 麦康凯液体培养基中，42 ℃条件下培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基上，35 ℃条件下培养18 h，以全自动微生物生化鉴定系统鉴定、确认。阴性对照组，除不加试验菌外，其余操作同试验组。阳性对照组，除不加供试液外，其余操作同试验组。平行检测3 次。

若检出并确认为大肠埃希菌，则可采用供试液制备方法及检查法进行供试品的大肠埃希菌检查。

2 结果

2.1 计数方法适用性

结果见表1。需氧菌总数（TAMC）计数方法的适用性研究结果表明，平皿法（1 ∶10 供试液）和稀释法（1 ∶20，1 ∶50 供试液）均不能有效去除供试液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用，回收试验失败；采用1 ∶10 供试液薄膜过滤会导致滤膜堵塞，无法过滤；采用1 ∶20 供试液平皿法与薄膜过滤法联用的方式可过滤，且各试验菌回收率均在0.5 ～2.0 之间，符合2015年版《中国药典》的要求。

表1 样品微生物计数法回收试验（n=3）Tab.1 Recovery test of the method for counting the microorganisms in a sample（n=3）

霉菌和酵母菌总数（TYMC）的计数方法适用性研究结果表明，可采用1 ∶10 供试液平皿法进行霉菌和酵母菌总数的检查，各试验菌回收率均在0.5 ～2.0 之间，符合2015年版《中国药典》的要求。

2.2 控制菌检查方法适用性

结果见表2。采用1 ∶10 供试液10 mL 分别接种至100，200 mL TSB 培养基中，试验菌均无法恢复生长，说明其无法有效去除供试液的抑菌性。采取1 ∶10 供试液10 mL 接种至500 mL TSB 培养基中进行方法适用性研究，大肠埃希菌在麦康凯琼脂培养基上的表型为表面光滑、湿润，桃红色圆形菌落，显微镜下观察结果为革兰阴性杆菌，两端钝圆，无芽孢。经系统确认为大肠埃希菌，表明该方法可用于样品的控制菌检查。

表2 样品控制菌检查方法适用性试验结果（n=3）Tab.2 The results of applicability test of the detection method of controlled bacteria test（n=3）

3 讨论

复方气管炎片的处方由瓜蒌、葶苈子、陈皮、茯苓、甘草、甲氧苄啶、盐酸异丙嗪、磺胺甲唑等组成，其中磺胺甲唑和甲氧苄啶复方为中效磺胺类药，且为广谱抑菌剂，对革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰阴性菌（如大肠埃希菌）均有较强的抗菌活性。瓜蒌中的瓜蒌子挥发油、瓜蒌皮总皂苷等对金黄色葡萄球菌有抑制作用[9]，陈皮中的双氢川陈皮素、川陈皮素具有抗炎、抗菌、抗氧化等药理作用[10]。甘草中的黄酮类化合物也有一定抑菌性[11]。因此，复方气管炎片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌等试验菌表现出较强的抑菌性。

具有抑菌作用的中药与西药复方制剂协同产生的较强且难以去除的抑菌性是建立复方气管炎片微生物限度检查法的主要障碍。本试验在进行TAMC 方法适用性研究时采用了平皿（直径150 mm）法联合稀释法，但无法完全去除抑菌性。采用中和法联合稀释法（即1 ∶50供试液100 mL 中加入对氨基苯甲酸溶液1 mL）仍无法去除对金黄色葡萄球菌的抑菌性，因此改用薄膜过滤法。对中药制剂进行方法适用性研究时，供试品中常存在较多药渣，采用薄膜过滤法易产生滤膜堵塞的问题[12-14]，限制了该方法的应用。因此，改用稀释法联合薄膜过滤法对TAMC 进行方法适用性试验。

中药制剂的理化性质和生物活性的特殊性，使在建立微生物限度检查法时常需联用药典要求的常用检测方法[15]，如采用稀释法和薄膜过滤法以消除其抑菌性[16]。稀释法能有效清除抑菌成分，达到检验目的[17]，稀释法和薄膜过滤法本质上都是降低或去除抑菌成分的抑菌性对检查结果的干扰，避免假阴性结果的产生[18]。本研究中联用2 种方法，有进一步去除抑菌性和易于过滤的优点，为建立具有较强抑菌性的中西药复方制剂的微生物限度检查方法提供了新思路。