动态浊度法检测复方蒲公英注射液中细菌内毒素

钱明明，刘益庆

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222000）

内毒素是革兰阴性菌的细胞壁成分，细菌死亡或自溶后释放，极微量进入人体即可引起发热反应[1]，大量时可导致休克、多器官衰竭甚至死亡[2-4]。因此需严格控制注射液中的内毒素，以保证用药安全。复方蒲公英注射液由蒲公英、鱼腥草及野菊花经提取加工制成，具有清热解毒、疏风止咳功效，多用于治疗风热感冒、肺胃热盛、发热头痛、咳嗽痰黄等症。该药现行质量标准为《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二十册）》（WS3-B-3917-98），肌肉注射，考虑到注射剂的安全性，故有必要增设细菌内毒素或热原检查项。相对于热原检查法，细菌内毒素检查法具有快速、灵敏、简便、重复性好、成本低等优点，同时从动物伦理学方面考虑，本研究中依据2015年版《中国药典（四部）》通则1143“细菌内毒素检查法”项下动态浊度法的基本原理及试验设计[5]，建立复方蒲公英注射液细菌内毒素的检测方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BET-72 型细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；涡旋振荡器（天津药典标准仪器厂）；200 μL及1000 μL 移液枪（德国Eppendorf 公司）。

1.2 试药

复方蒲公英注射液（江西天施康中药股份有限公司，批号分别为19020303，19030520，19040316，规格为每支2 mL）；鲎试剂（TAL，湛江安度斯生物有限公司，批号为1904260，规格为每支1.25 mL，检测范围0.005 ～50 EU/mL）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号为150601-201987，规格为每支80 EU）；细菌内毒素检查用水（BET 用水，湛江安度斯生物有限公司，批号为1910180，规格为每支30 mL）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）确定

公式为L=K/M[5]，K为人体每1 kg 体质量每1 h可接受内毒素的最大剂量，注射剂K=5 EU/（kg·h）；M为人用每1 kg 体质量每1 h 的最大供试品剂量，按复方蒲公英注射液说明书规定，单次最大注射剂量为4 mL，按60 kg 体质量计，则M=0.067 mL/（kg·h）。L=75 EU/mL，由于该药涉及儿童用药，为保障安全用药，根据注射剂安全性检查法应用指导原则，可将限值严格至计算值的1/2 ～1/3，故最终确定L为25 EU/mL。

2.2 标准曲线可靠性试验

取细菌内毒素工作标准品1 支（80 EU），加入1.0 mL BET 用水复溶，制成浓度为80 EU/mL 的贮备液，用BET用水分别稀释成浓度为0.005，0.050，0.500 EU/mL 的系列标准内毒素溶液，每个浓度设3 个平行管。用BET用水作阴性对照，设2 个平行管。精密量取上述标准溶液及阴性对照溶液各100 μL，分别加入预先加有100 μL TAL 的试管中，混匀，采用细菌内毒素测定仪测定。测定条件，温度为（37±0.5）℃，检测波长为405 nm，反应时间为3600 s。以细菌内毒素标准品浓度的对数（lgC）为横坐标，以反应时间的对数（lgT）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程lgT=2.78568-0.32468 lgC（|r| =0.9992）。细菌内毒素浓度线性范围为0.005 ～0.500 EU/mL；各组平行管变异系数（CV）小于10%，阴性对照反应时间长于标准曲线最低浓度的反应时间，表明试验方法有效。结果见表1。

表1 标准曲线可靠性试验结果（n=3）Tab.1 Results of reliability test（n=3）

2.3 供试品最大有效稀释倍数（MVD）计算

根据MVD=cL/λ，其c=1.0 mL/mL，λ 为标准曲线的最低浓度0.005 EU/mL，则MVD=5000 倍。

2.4 干扰试验

设0.050 EU/mL 为λm，用BET 用水将样品（批号为19020303）分别稀释为100，200，500，1000 倍的溶液，记为A 液；制备含标准内毒素0.050 EU/mL 的A 液，记为B 液；取A 液、B 液各100 μL，分别加入预先加有100 μL TAL 试剂反应试管中，每个浓度设2 个平行管，混匀，采用细菌内毒素测定仪测定[5]。结果样品及其外加细菌内毒素稀释100，200，500，1000 倍时，回收率均在50% ～200%范围内，表明样品在该系列稀释倍数下无干扰作用。结果见表2。

表2 干扰试验结果（n=2）Tab.2 Results of interference test（n=2）

2.5 准确度试验

取样品（批号为19020303）1 支，稀释100 倍，分别加入0.005，0.050，0.500 EU/mL 的标准内毒素，平行测定3 次。结果供试品的平均回收率均在50% ～200%范围内，且CV均小于10%，表明该方法准确度较好。详见表3。

表3 准确度试验结果（n=3）Tab.3 Results of accuracy test（n=3）

2.6 精密度试验

取2.2 项下0.005，0.050，0.500 EU/mL 的系列标准内毒素溶液，采用细菌内毒素测定仪检测，平行测定3 次。结果3 个浓度的标准内毒素溶液检测结果的CV均小于10%，表明该方法精密度良好。详见表4。

表4 精密度试验结果（n=3）Tab.4 Results of precision test（n=3）

2.7 样品检测

以所建动态浊度定量检测法检测3 批样品的细菌内毒素含量。结果回收率均在50% ～200%范围内，CV均小于10%，3 批样品内毒素含量均小于检测限（0.005 EU/mL）。详见表5。

表5 样品细菌内毒素检测结果Tab.5 Results of detection of bacterial endotoxin in the samples

3 讨论

复方蒲公英注射液现行质量标准无热原或细菌内毒素检查项，根据2015年版《中国药典（四部）》注射剂安全性检查法应用指导原则，对生产工艺易污染细菌内毒素的肌肉注射用注射剂，应考虑设细菌内毒素检查项。本研究中参考文献[6-10]，采用动态浊度法验证复方蒲公英注射液细菌内毒素检测方法，结果表明，内毒素标准品浓度线性范围为0.005 ～0.500 EU/mL，样品稀释100 倍及以上，回收率均在50% ～200% 范围内，表明该系列稀释倍数下供试品无干扰作用，测得的细菌内毒素数值真实、有效，样品稀释100 倍时，回收率最接近100% ，故后续供试品细菌内毒素含量检测采用该稀释倍数。随后对该方法的准确性及精密性进行验证，结果回收率均在50% ～200% 范围内，且CV均小于10%，表明该方法结果准确。在方法的初步应用中，3 批样品细菌内毒素含量均低于检测限，表明该厂家目前对其细菌内毒素含量控制较好。

与传统定性凝胶法比较，动态浊度法检测结果由仪器自动执行，且能直观显示供试品中内毒素的含量，灵敏度更高，重复性更好，能大范围定量，数据具有可追溯性，可避免主观因素影响结果的判断[11]，更适用于生产过程中对供试品质量的监控。

综上所述，本研究所建动态浊度法操作简便，准确性及精密度良好，灵敏度高，抗干扰能力强，能快速定量供试品细菌内毒素，可用于复方蒲公英注射液生产过程中细菌内毒素的定量检测。