不同种源多穗柯主要生物活性成分与矿质元素含量变异分析

何 平，厉月桥，刘 儒，喻龙华，冯 慧，谢健杨

（1.中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600；2.新余学院 a.护理与康复学院；b.经济管理学院，江西 新余 338004）

多穗柯Lithocarpus polystachyus又名甜茶，为壳斗科石栎属植物，主要分布在我国长江以南亚热带丘陵山地区，江西、湖南、广西和安徽等省区资源分布较为集中，广东、云南、四川、福建等省次之[1]。民间常采集多穗柯的嫩叶食用，其茶甘甜清爽，香气浓郁，色泽鲜艳，回味持久，风味独特，兼具茶、糖、药三种功能[2]。现代医学研究表明，根皮苷、三叶苷和黄酮类等为多穗柯的主要功能成分[3]，具有抑菌消炎[4]、抗氧化[5]、降低血糖血脂[6]、抑制糖尿病[7]和抗癌防癌[8]等功能。随着亚热带地区杉木、松类人工林的大面积栽培，多穗柯天然生境遭受严重破坏，开展多穗柯的种质收集、评价工作，选育药用成分含量高、生态适应性强的优良种质进行人工栽培对多穗柯种质的保护和利用十分重要。

目前，国内外关于多穗柯研究主要集中在化学成分分析[9]、有效成分提取[10]、功能验证[6,11]、叶绿体基因组测序与功能基因克隆[12-13]和人工定向栽培方面[12-14]。许多林木经济生态性状与原产地气候、生态因子密切相关，并在长期进化过程中形成特定的地理变异模式[15]，是开展遗传改良和产地调拨的依据。多穗柯种质评价是遗传改良的基础，曾祥艳等[16]对广西4 个产地多穗柯叶片性状变异及幼林生长量的研究表明，不同多穗柯优树在种子形态和子代生长方面变异较大。黄晓露等[17]研究表明不同产地多穗柯幼树生长、叶片形态和光合生理性状方面存在明显差异。王坤等[18]对6 省30 个多穗柯种源苗木成熟叶片根皮苷和幼嫩叶片的三叶苷含量进行了测定，证实不同种源多穗柯根皮苷和三叶苷含量亦存在差异。

多穗柯叶片三叶苷、根皮苷、总黄酮和碳氮磷钾等大量矿质元素含量，是经济有效性和环境适宜性的重要性状指标。但现有研究还未能揭示多穗柯叶片三叶苷、根皮苷、总黄酮和主要矿质元素的地理种源变异模式及其与原产地地理、气候、生态因子和内部性状指标间的相关关系。

本研究在对我国多穗柯天然分布区进行种源收集的基础上，开展了不同种源叶片根皮苷、三叶苷、总黄酮及全氮、全磷、全钾和有机碳含量特征的地理变异规律研究，旨在为多穗柯经济生态型优良种质选择和遗传改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集与处理

多穗柯种源选择与气象信息收集见表1。在查阅多穗柯地理分布资料的基础上，选择江西、广西、重庆、四川和湖南5 省（区）5 个种源地作为多穗柯样品收集地，采种源样本基本覆盖了多穗柯在中国的主要地理分布区，与温度相关的气象因子计算时，以当地气象台站数据为依据，海拔每上升100 m 气温降低0.55℃进行修正[19]。

多穗柯种源无性系测定林的建立。在选择的采样植株上，外围中部采集当年生枝条，在中国林科院亚热带林业实验中心苗圃扦插扩繁，获得了江西分宜、四川米易、广西田林、重庆北碚和湖南溆浦5 个种源无性系，每种源无性系扩繁数量均在50株以上，将扩繁的无性系栽植在容积为直径10 cm和高15 cm 的轻基质育苗容器袋内，容器基质是体积比为3∶6∶1 的泥炭、锯末树皮混合物和黄心土混合物，然后进行多穗柯种源无性系测定试验。

多穗柯无性系测定试验采用完全随机区组设计，以扩繁的种源无性系作为处理，每个处理选择生长一致的多穗柯植株10 株，重复4 次，然后条件一致的育苗荫棚内进行培育。生长1 a 后，在不同种源各无性系植株上分别采集发育完好的叶片10 片左右，进行有效成分、表型和矿质元素含量的测定。

1.2 样品检测与分析

1.2.1 总黄酮、根皮苷和三叶苷的测定

将多穗柯叶片样品取回后用清水洗净，放入110℃烘箱杀青30 min，然后45℃烘箱中烘干至恒质量。将烘干后的多穗柯样品分单株粉碎过100目筛，作为待测样品。

总黄酮的测定采用三氯化铝法[20]。称取粉碎样品0.2 g，3 mL 95% 乙醇，50 ℃水浴超声30 min，收集至10 mL 容量瓶，重提3 次，合并上清液，冷却至刻度，备用。取7 mL 上清液于25 mL 的比色管中，加入1.5% AlCl38 mL 和醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH 值5.5）4 mL，并用50% 乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h，于415 nm下测试吸光度值。配置一系列浓度的标准溶液，按照上述样品溶液的显色方法同步显色，于415 nm下测试吸光度值，以吸光度为纵坐标，显色液中芦丁的质量（mg）为横坐标，作标准曲线，得到标准曲线方程并计算样品的总黄酮含量。

采用高效液相色谱法测定根皮苷和三叶苷[21]。称取0.1 g 左右样品，加入50 mL 甲醇，超声提取30 min（500 W，40 kHz），0.22 有机滤膜过滤，进样。色谱柱为Waters C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；进样量20 μL。根皮苷和三叶苷标准品和多穗柯样品根皮苷和三叶苷的HPLC 色谱见图1～2。

1.2.2 有机碳、全氮、全磷和全钾含量的测定

多穗柯样品有机碳采用重铬酸钾容量法（硫酸亚铁滴定法），即用K2Cr2O7-H2SO4进行待测样外加热，再用FeSO4进行滴定；将多穗柯样品用浓H2SO4混合试剂消煮法制备待测液，再用靛酚蓝比色法测定其全氮，用钼锑抗比色法测定其全磷；利用原子吸收分光光度计（Zeenit700，德国Analytik Jena AG）测定其K 浓度[22]。每个样品测定重复3 次，结果取平均值。

表1 多穗柯种源地理位置及主要气象因子†Table 1 Geographical locations and meteorological factors of the sampled provenances of Lithocarpus polystachyus

1.3 数据分析

利用Excel 2010 软件进行基础数据的整理、统计，利用SPSS 17.0软件进行种源间的方差分析、多重比较、相关分析和聚类分析。

图1 根皮苷和三叶苷标准品的HPLC 色谱Fig.1 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin standard

图2 多穗柯样品根皮苷和三叶苷的HPLC 色谱Fig.2 The HPLC chromatography of phloridzin and trilobatin in Lithocarpus polystachyus sample

2 结果与分析

2.1 多穗柯叶主要药用活性成分与矿质元素含量的差异

不同种源多穗柯叶表型与主要药用成分含量间差异见表2。从表2可以看出，在叶部药用活性成分含量方面，多穗柯叶部根皮苷的变异范围为16.03～64.35 mg·g-1，重庆北碚种源根皮苷含量最高，达64.35 mg·g-1，是根皮苷含量最低的四川米易种源的4.01 倍。三叶苷含量的变异范围为4.76～29.97 mg·g-1，含量最高的四川米易种源与最低的重庆北碚种源间相差了6.29 倍。不同种源总黄酮含量的变异幅度为61.59～81.05 mg·g-1，其中江西分宜种源含量最高，四川米易种源含量最低。

表2 不同种源多穗柯主要药用活性成分与矿质元素含量的种源差异†Table 2 Provenance difference of main medicinal active constituents and mineral element contents of Lithocarpuspolystachyus from different provenances (mg·g-1)

在多穗柯叶主要矿质元素含量方面，有机碳含量的变异范围为45.82～44.12 mg·g-1，氮元素含量的变异范围为13.64～17.05 mg·g-1，磷元素含量的变异范围为1.25～3.37 mg·g-1，钾元素含量的变异范围为6.70～7.31 mg·g-1。不同种源各矿质元素间分别相差了1.04、1.25、2.69 和1.09 倍。方差分析表明，除钾元素含量外，不同种源多穗柯叶根皮苷、三叶苷、总黄酮、有机碳、氮、磷元素含量方面均存在极显著差异（P＜0.01）。

2.2 多穗柯叶表型与主要活性成分含量与气候生态因子相关性分析

从表3可以看出，根皮苷与日照时数呈显著负相关关系，三叶苷与无霜期呈显著正相关关系，总黄酮含量与年均降水量呈显著正相关关系，与经度呈极显著正相关关系，相关系数可达0.999。多穗柯其它活性成分、有机碳、全氮、全磷和全钾含量与气候生态因子间无显著相关性。说明，随着原产地日照时数的增加，多穗柯根皮苷呈显著降低的趋势；随着无霜期的增加，三叶苷含量呈逐渐增加的趋势；随着经度和年均降水量的增加，多穗柯总黄酮含量分别呈极显著或显著增加的趋势。

表3 多穗柯叶主要药物活性成分、矿质元素与产地气候生态因子相关性分析†Table 3 Correlation analysis of main medicinal active constituent,mineral elements and climatic and ecological factors of Lithocarpus polystachyus leaves

2.3 多穗柯叶主要药物活性成分与矿质元素含量的相关分析

从表4可以看出，多穗柯叶部根皮苷与全氮呈极显著正相关关系（P＜0.01）；有机碳与全钾含量呈显著负相关关系（P＜0.05）。随着钾元素的增加，有机碳含量呈显著降低的趋势，多穗柯叶片其它性状间相关性未达到显著差异水平（P≥0.05）。说明，随着全氮含量的增加，根皮苷呈极显著增加的趋势。

表4 多穗柯叶表型与主要活性成分的相关性分析Table 4 Analysis of correlation between leaf phenotype and main medicinal active constituent of Lithocarpus polystachyus

2.4 不同种源多穗柯药用成分含量聚类分析

以多穗柯叶部根皮苷、三叶苷、总黄酮含量为特征指标，对5 个多穗柯种源进行聚类分析，结果（图3）表明，以欧式距离15 为分界阈值，可将多穗柯种源聚类为高根皮苷、高总黄酮、低三叶苷类群，低根皮苷、低总黄酮和高三叶苷类群，其中重庆北碚、江西分宜和湖南溆浦属高根皮苷、总黄酮和低三叶苷类群，而广西田林、四川米易为低根皮苷、低黄铜和高三叶苷类群。从地理位置分布来看，前者主要分布在多穗柯分布区的中部，而后者主要分布在其分布区的西南部。

图3 不同种源多穗柯叶根皮苷、三叶苷和总黄酮含量聚类分析Fig.3 Cluster analysis of phloridzin and trilobatin and flavonoids contents in Lithocarpus polystachyus-leaf of different provenances

3 结论与讨论

1）本研究报道了我国优良药食兼用树种多穗柯叶部主要生物活性成分和矿质元素特征的种源变异研究结果。研究发现，来自5 省区5 个产地多穗柯秋季成龄叶部根皮苷、三叶苷、总黄酮、全氮、全磷和有机碳含量差异极显著。其中重庆北碚、江西分宜和湖南溆浦种源属高根皮苷、总黄酮和低三叶苷类群，分布在广西田林和四川米易种源属低根皮苷、低黄酮和高三叶苷类群。各种源中，重庆北碚根皮苷含量最高，为64.35 mg·g-1；四川米易三叶苷含量最高，达29.97 mg·g-1；江西分宜总黄酮含量最高，达81.05 mg·g-1，属多穗柯优良种源。今后应当加强优良种源在生产中的利用。

2）王坤等[18]证实了不同种源多穗柯老叶根皮苷含量、嫩叶三叶苷含量种源间存在差异，但未开展主要经济性状种源变异与原产地地理气候因子间关系的研究。本研究发现，多穗柯叶部主要生物活性成分和矿质元素含量间及其与原产地气候生态因子间具有一定相关性。其叶部根皮苷含量与原产地日照时数呈显著负相关，三叶苷含量与无霜期呈显著正相关关系，总黄酮与降水量和经度分别呈显著和极显著正相关关系。因此，今后在多穗柯分布区内短日照地区开展高根皮苷优良种质选择，在其东部或高降水量地区开展高黄酮优良种质筛选，在无霜期较长的地区开展高三叶苷含量优良种质选择，有望取得较好的效果。

3）在进行多穗柯种质资源评价时，总黄酮指标含量的测定需利用液相色谱设备检测分析，测定费时费力，而叶片氮含量相对容易检测。本研究发现，多穗柯根皮苷与氮含量呈极显著正相关关系。因此，在今后多穗柯种质评价时，可以用叶全氮含量进行三叶苷含量的初步评价，有利于提高种质资源评价效率和降低成本。

4）市场上，多穗柯成龄叶和春季嫩叶具有不同加工利用方向。多穗柯嫩叶主要用于制作茶叶，而成熟叶主要用于根皮苷、三叶苷等生物活性成分和甜味剂的提取。已有研究表明，多穗柯成熟叶中根皮苷含量高于嫩叶，但三叶苷含量低于嫩叶[24]。本研究开展了多穗柯秋季成熟叶中根皮苷、三叶苷和总黄酮含量的检测和地理变异规律研究，尚未对春季嫩叶中相关成分含量进行分析。因此，春季嫩叶中根皮苷、三叶苷等特征指标的种源变异规律有待进一步开展研究，以便为多穗柯茶用型优良品种选育提供科学依据。

5）林木的遗传变异是来源于群体间和群体内多层次上的，揭示遗传变异的来源能够为树种的良种选育提供科学的指导。林木种源与地点往往存在明显的交互作用，往往需进行多点联合种源试验，才能揭示在不同地区的生长表现[25]。本研究仅在江西分宜进行多穗柯种源试验研究，明确了其主要生物活性成分和矿质元素的种源间差异，但尚未对种源内部群体间差异情况开展分析。同时，也因未开展全分布区种源试验，尚不能明确各种源在全分布区的表现。因此，开展多穗柯全分布区种源试验和开展群体内变异研究，以系统揭示多穗柯重要经济性状的种源变异规律，为多穗柯优良种源的筛选和推广应用提供科学依据。