壳寡糖对奶牛外周血单个核细胞抗氧化功能的促进作用

郑亚光 齐敬宇 张博綦 赵艳丽 郭晓宇 史彬林 闫素梅

(内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018)

自由基是正常呼吸、新陈代谢和异种生物自氧化的副产物[1]。处于不同泌乳阶段的奶牛经常暴露在活性氧(ROS)自由基中，由于高产奶牛具有较高的营养和生理代谢水平，引起一氧化氮(NO)等自由基在体内的过量积累，当机体内抗氧化剂对自由基清除不足时，多余的自由基会对细胞膜造成损害，使细胞功能发生改变，从而导致组织和器官的功能紊乱与氧化应激，并伴随一系列疾病的产生，在奶牛中会导致乳腺炎和生殖障碍、乳房水肿、胎盘残留、乳腺炎等，对奶牛的生产周期产生不利影响，降低产奶量和经济价值[2]。因此，为动物补充抗氧化剂是调节抗氧化系统、降低氧化应激的有效途径[3]。壳聚糖通过酸水解和酶降解方法可得到壳寡糖(COS)，它是一种由β-1,4-糖苷键连接的二氨基葡萄糖的低聚物，具有水溶性、无细胞毒性、容易通过肠道吸收等特点[4]。COS还被证明具有多种生物活性，包括抗炎、免疫刺激、抗氧化[5]，其理化性质与壳聚糖非常相似[6]。COS可提高细胞内过氧化氢酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)含量，表明COS在活细胞中可以作为有效的抗氧化剂[7]。一些报道指出壳聚糖及其衍生物可以提高奶牛的抗氧化功能和免疫功能[4-5]，但其影响机理尚不清楚。NO是一种通过一氧化氮合酶将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的具有信号调节功能的自由基，然而，长期过量的NO生成与许多疾病有关[8]。过量的NO对奶牛乳腺上皮细胞造成了氧化损伤，并诱导了炎症因子的产生[9]。以小鼠胰腺β细胞系MIN6为模型的研究指出，COS对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化损伤的保护作用机制与其显著抑制了NO的产生有关[10]。脂多糖(LPS)诱导小鼠264.7巨噬细胞氧化应激的研究表明，COS可以通过调节核因子-κB(NF-κB)信号通路和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达抑制NO的生成，缓解细胞氧化应激[11]。这些结果提示COS可以调节奶牛的抗氧化功能，其机制可能与COS通过NF-κB信号通路调节NO的生成有关。

外周血单个核细胞(PBMC)是一类重要的免疫效应细胞，能够反映机体感染及疾病的发生，其抗氧化应激能力与奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相关。PBMC是抵御病原体入侵的第1道免疫防线，它通过产生炎性介质，如细胞因子和趋化因子，通过吸引其他免疫细胞到炎症部位而有效地调节炎症过程[12]。在奶牛上的研究表明，疾病(如口蹄疫)发生时，由PBMC释放的NO使血清中NO含量上升[13]。本试验以奶牛PBMC为模型，通过体外试验研究COS对PBMC的细胞活力、抗氧化酶活性及炎症因子含量及其基因表达的影响，进一步从体外验证COS对奶牛PBMC抗氧化功能的调节作用，并通过检测NO合成相关酶活性及其基因表达以及NF-κB信号通路相关基因表达，进一步探讨COS对奶牛PBMC抗氧化功能的调节是否与降低了NO的生成有关。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PBMC采用Ficoll密度梯度离心法分离培养制备。COS，食品级，脱乙酰度≥85%，相对分子质量≤3 000，粒度≥140目，水分含量≤10%，购自济南某生物工程有限公司。

1.2 试剂配制

COS工作液配制:准确称取0.32 g COS，溶解在10 mL不含血清的RPMI-1640培养基中，配制成浓度为32 mg/mL的COS一级母液。取1 mL一级COS母液溶解于9 mL不含血清的RPMI-1640培养基中，配制成浓度为3.2 mg/mL的COS二级母液。取COS二级母液继续溶解于不含血清的RPMI-1640培养基中，依次进行稀释，获得终浓度为320、160、80、40 μg/mL的工作液，母液和工作液均通过0.22 μm滤器过滤除菌。

1.3 PBMC的分离培养

本试验所用到的血样是从沙梁牧场(呼和浩特市)采集的，来自3头健康荷斯坦奶牛[泌乳天数(200±15)d，产奶量(34.80±4.95)kg/d，胎次为3胎]，于晨饲前空腹尾静脉采血，使用含EDTA抗凝剂的抗凝血采血管采集血液并于12 h内完成细胞的分离。PBMC分离方法根据English等[14]和Ferrante等[15]的研究进行，简要步骤如下：使用牛PBMC分离液KIT中的稀释液按1∶1比例对混合后的血液进行稀释，在15 mL离心管中将稀释后的血液按照与分离液1∶1的比例小心地加于牛PBMC分离液上方，在水平离心机(Beckman，美国)中400～500×g分离30 min，离心后由上至下分为4层，第1层为血浆层，第2层为环状乳白色PBMC层，第3层为透明分离液层，第4层为红细胞层。吸取第2层的细胞层并用PBS重悬清洗细胞，250×g离心10 min后弃上清，重复清洗细胞2次后，将细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬并接种于25 cm2培养瓶中，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

1.4 试验设计

本试验采用单因素随机试验设计，将分离得到的PBMC随机分为5组，进行如下处理：对照组(CON组)细胞培养液中不添加COS(0 μg/mL COS)；COS40、COS80、COS160和COS320组在细胞培养液中分别添加40、80、160和320 μg/mL的COS，每个处理6个重复。即将细胞接种于含有RPMI-1640培养基的25 mL细胞培养瓶中，使培养瓶中的COS的终浓度达到上述5个浓度，在培养箱中培养48 h。将培养后的细胞一部分接种于96孔培养皿中，用于细胞活力的检测，每个孔的接种密度为1×106个/mL；另一部分细胞直接收集细胞上清液和细胞用于后续试验。

1.5 样品采集

细胞上清液：将每个重复的培养瓶中的细胞吹打混匀后，吸取1 mL于1.5 mL无菌无酶的离心管中，水平离心机中250×g离心10 min，将细胞上清液吸取转移至新的1.5 mL离心管内，用于抗氧化相关酶活性和炎症因子含量的检测。

细胞样品的制备：继上述培养瓶中细胞250×g离心10 min后，弃掉多余的上清液，在1.5 mL离心管内加入1 mL PBS重悬细胞，250×g离心10 min后弃除PBS，清洗细胞2次后，加入1 mL Trizol Plus于冰上反复吹打裂解细胞，用于后续RNA的提取。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 细胞活力与抗氧化指标

采用CCK-8法测定奶牛PBMC的细胞活力。将根据试验设计培养处理后的细胞悬液加于96孔板，每孔100 μL，细胞密度1×106个/mL，每个孔加入CCK-8 10 μL，用枪头与细胞混匀后孵育细胞1 h左右，使用全自动酶标仪(BioTek Synergy H1，美国)测定450 nm处的吸光度(OD)值，孵育时间的长短以使对照组的OD值接近于1为宜(OD值控制在1时较为稳定，本试验的孵育时间为1 h)。细胞活力计算公式如下：

细胞活力=试验组OD值/对照组OD值。

细胞上清液中CAT、SOD、GPx、TrxR的活性根据试剂盒说明书，使用全自动分光光度计(UN2CO-WFT2100，Aoyi，中国)进行检测。

1.6.2 ROS、iNOS活性以及NO与炎症因子含量

细胞上清液中ROS、iNOS活性以及NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量根据试剂盒说明书进行，使用全自动分光光度计或全自动酶标仪进行检测。

1.6.3iNOS、炎症因子和NF-κB信号通路相关基因表达

表1 引物信息

1.7 数据处理与分析

本试验的数据通过Excel 2013整理计算，使用SAS 9.4软件的GLM程序和回归分析(线性和二次效应)程序进行分析，并采用Duncan氏多重比较法评估组间差异显著性。当P<0.05时，表明差异具有显著性，而当0.05≤P<0.10时表明差异具有统计学显著性的趋势，P≥0.10时表明差异不显著。

2 结果与分析

2.1 细胞活力、抗氧化酶活性和炎症因子含量

由表2可知，各COS组的细胞活力在数值上均高于CON组，但组间差异不显著(P≥0.10)。与CON组相比，COS80、COS160、COS320组的TrxR活性显著升高(P<0.05)，其中以COS80组的活性最高，并显著高于COS40组(P<0.05)；回归分析得出，随着COS剂量的增加，TrxR活性呈显著的二次曲线升高(P=0.043)。SOD的活性以C160和C320组较高，趋于显著地高于CON组(P=0.095)；回归分析得出，SOD的活性随COS剂量的增加呈显著的线性升高(P=0.032)。回归分析得出，CAT活性随COS剂量的增加呈现显著的二次曲线升高(P=0.013)，以COS80组的活性最高，趋于显著地高于CON和COS320组(P=0.063)，且COS320组与CON组之间无显著差异(P≥0.10)。

表2 COS对细胞活力、抗氧化酶活性和炎症因子含量的影响

与CON组相比，COS40、COS80、COS160组的TNF-α含量显著降低(P<0.05)，尤以COS160组含量最低，COS320组显著高于COS160组(P<0.05)，但与CON组和其他COS组无显著差异(P≥0.10)；回归分析得出，TNF-α含量随COS剂量的增加呈显著的二次曲线降低(P<0.001)。COS40组NO含量显著高于CON组(P<0.05)，COS160组的NO含量显著低于CON组(P<0.05)，COS80、COS160、COS320组NO含量显著低于COS40组(P<0.05)，以COS160组的含量最低；回归分析得出，随着COS剂量的增加，NO含量呈趋于显著的线性降低趋势(P=0.052)。IL-1β、IL-6含量随COS剂量的增加先下降后上升，COS40和COS80组IL-1β含量趋于显著地低于COS320组(P=0.058)，COS80组IL-6含量趋于显著地低于COS320组(P=0.090)；回归分析得出，随着COS剂量的增加，IL-1β含量呈趋于显著的二次曲线降低趋势(P=0.073)，IL-6含量呈趋于显著的线性降低趋势(P=0.068)。ROS活性随COS剂量的增加而下降，但各组间差异不显著(P≥0.10)。与CON组相比，COS80、COS160和COS320组的iNOS活性显著降低(P<0.05)，其中以COS160组最低；回归分析得出，随着COS剂量的增加，iNOS活性呈显著的二次曲线上升(P=0.005)。COS剂量对GPx活性没有产生显著影响(P=0.399)。

2.2 iNOS、炎症因子和NF-κB信号通路的基因表达

由表3可知，与CON组相比，各COS组NF-κBp50和NF-κBp65的mRNA相对表达量均显著下降(P<0.05)，其中NF-κBp50的mRNA相对表达量以COS160、COS320组较低，NF-κBp65的mRNA相对表达量以COS160组最低；回归分析得出，随着COS剂量的增加，NF-κBp50的mRNA相对表达量呈显著的线性下降(P<0.001)，NF-κBp65的mRNA相对表达量呈显著的二次曲线降低(P<0.001)。COS40、COS80和COS160组iNOS的mRNA相对表达量显著低于CON组(P<0.05)，但COS320组显著高于CON组和其他COS组(P<0.05)。COS80和COS160组TNF-α的mRNA相对表达量显著低于CON、COS40和COS320组(P<0.05)，CON、COS40和COS320组之间无显著差异(P≥0.10)；回归分析得出，iNOS和TNF-α的mRNA相对表达量均随COS剂量的增加呈显著的二次曲线降低(P<0.001)。IL-1β的mRNA相对表达量随COS剂量的增加先降低后升高，其中以COS80组最低且趋于显著地低于COS320组(P=0.088)，但与CON组相比无显著差异(P≥0.10)；回归分析得出，IL-1β的mRNA相对表达量随COS剂量的增加呈趋于显著的二次曲线降低趋势(P=0.060)。

表3 COS对iNOS、炎症因子和NF-κB信号通路相关基因mRNA相对表达量的影响

3 讨 论

3.1 体外添加COS对奶牛PBMC抗氧化功能和炎症因子的调节作用

PBMC包括淋巴细胞和单核细胞，是机体主要的血液免疫细胞，能够反映机体感染及疾病的发生，其抗氧化应激能力与奶牛的抗氧化功能和免疫功能密切相关。通常，内源性抗氧化剂包括SOD、GPx、CAT和TrxR在内的酶抗氧化剂，是细胞内抗氧化防御的主要形式。SOD催化超氧阴离子歧化为H2O2和氧分子(O2)，因此使潜在有害的超氧阴离子的危害性降低；GPx可将H2O2分解为水[16]，血浆GPx活性与脂质过氧化物含量有关；CAT是一种常见的抗氧化酶，几乎存在于所有利用氧气的活组织中，催化H2O2还原为水和O2；TrxR组成了硫氧还蛋白(Trx)系统，是重要的抗氧系统[17]。根据本试验结果，体外PBMC中添加COS对TrxR、CAT和SOD活性的促进作用呈二次曲线剂量依赖效应，其中以COS80和COS160组效果较好；而COS320组CAT活性与COS160组相比有降低趋势，与CON组相近，说明COS对奶牛PBMC的抗氧化相关指标的促进作用呈剂量依赖性。已有体内试验指出，在大鼠饲粮中添加COS可以提高SOD、CAT、GPx活性和总抗氧化能力(T-AOC)，降低血清、肝脏、脾脏中的丙二醛(MDA)含量，通过减轻脂质过氧化和恢复抗氧化能力，保护大鼠免受H2O2的损伤[18]。本试验从体外印证了COS可提高PBMC的抗氧化功能。

在PBMC中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子含量的高低可以反映细胞的炎症反应，受到如LPS等刺激后，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子会大量产生引起炎症反应[19]。本试验中IL-1β、TNF-α和NO的含量及其基因的mRNA相对表达量随着COS剂量的增加呈显著或趋于显著的二次曲线降低，其中以COS160组的含量最低，IL-6的含量也有下降的趋势，说明COS在改善奶牛PBMC抗氧化功能的同时，对炎症因子的产生也具有剂量依赖性的抑制作用，COS320组对炎症因子的产生没有表现出显著的抑制作用。

3.2 COS促进奶牛PBMC抗氧化和降低炎症反应的机理

在炎症过程中，乳腺的巨噬细胞和上皮细胞产生大量的NO在乳腺炎期间介导炎症，过量释放的NO会对奶牛的组织器官(如乳腺等)造成氧化损伤[20]。有研究表明，体外刺激小鼠巨噬细胞时，iNOS的表达增强，会导致NO、TNF-α和白细胞介素(IL)大量产生[21]。iNOS的表达受转录因子NF-κB信号通路的调控，在正常细胞中，胞浆中的NF-κB信号通路是非活性的，由蛋白二聚体(p65/p50)和NF-κB抑制蛋白(IκB)抑制剂组成[22]，NF-κB信号通路一旦被激活，p65/p50二聚体可以迁移到细胞核中，启动炎症因子如IL-1β、TNF-α和iNOS等相关基因的转录，促进NO大量生成[23]。有体内试验也表明，壳聚糖可通过NO分子途径发挥免疫调节功能[24]。本试验中，通过对NF-κBp50和NF-κBp65基因表达的检测发现，体外添加COS对奶牛PBMC的NF-κB信号通路具有抑制作用，并呈现线性剂量依赖效应，与CON组相比，各COS组中iNOS活性及其基因的mRNA相对表达量及NO的含量均随COS剂量的增加先降低后升高，其中COS160组最低，COS320组出现升高趋势，表明COS可以在一定范围内对奶牛PBMC中iNOS的表达具有抑制作用，并降低NO的产生；同时，免疫因子IL-1β和TNF-α的mRNA相对表达量也随COS剂量的增加呈下降趋势。这提示，COS提高PBMC的抗氧化功能，抑制炎症反应的反生，可能与其对NF-κB信号通路活性的抑制降低了NO的生成有关。有研究指出，低分子质量的硫酸化壳寡糖可抑制LPS诱导导致的NO、IL-6和TNF-α等炎性介质的产生，并通过NF-κB信号通路活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的巨噬细胞中IL-6和TNF-α的产生[25]，因此，今后可从MAPK信号通路进一步探讨COS影响PBMC抗氧化功能与炎症因子产生的机理。

4 结 论

体外添加COS对奶牛PBMC抗氧化功能的促进作用及其对炎症因子产生的抑制作用呈剂量效应，其中以160 μg/mL COS的效果较好，但320 μg/mL COS对炎症因子产生的抑制作用减弱；COS抑制了NF-κBp50和NF-κBp65的基因表达，COS可能通过抑制NF-κB信号通路活性，降低iNOS与炎症因子IL-1β和TNF-α的基因表达，降低NO的生成，进而提高抗氧化应激能力。