妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管生成相关基因表达的影响

彭思嘉 李鹤琼 罗海玲 王 波 李 贞 王月君

(中国农业大学动物科技学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

胎儿生长发育的营养完全来自于母体，妊娠期母体营养不足会严重影响胎儿生长，多胎品种因胎儿数量的增加更易出现这一情况。湖羊作为我国特有的绵羊品种，具有早熟、多胎、早期生长快等特点。有研究表明，在湖羊妊娠后期持续供应全价营养有利于胎儿的指数级生长[1]；绵羊在妊娠后期限饲，营养水平越低，胎儿受限越严重[2]。因此，保证妊娠期母体营养充足可以减少母体和胎儿出现不利情况，合理利用母畜生产优质后代，提高生产效率。

叶酸参与核酸和蛋白质的合成，在细胞分裂过程中起重要作用，也是胎盘发育、血管生成的必需条件[3]。叶酸可以通过减少胚胎死亡而提高动物的繁殖能力，对猪和绵羊等多胎动物的胚胎存活和胎儿发育至关重要[4-6]，不足时可能引发心血管疾病[4,7]。绵羊血清叶酸含量在妊娠期间呈先下降后上升的趋势，并且这一现象在高产品种中更为明显[6]。随着饲养集约化程度的提高，饲粮的变化会影响动物的生长，因此推测高产母羊在妊娠期间对叶酸的需求量可能会增加，无法完全通过饲粮和瘤胃微生物合成来满足。

胎盘作为妊娠期母体和胎儿之间运输营养物质、气体和代谢产物的器官，其血管发育与胎盘本身的生长以及胎盘功能正常发挥都密切相关，这对胎儿正常生长和初生重至关重要[3,8-11]。胎盘血管功能不全是胎儿生长受限最常见的病因之一[12]，甚至引发胎儿或母体出现如宫内生长受限、妊娠高血压、子痫前期、流产、早产或死胎等现象[8]。

本团队前期研究发现，妊娠母羊饲粮添加过瘤胃叶酸可以显著增加新生羔羊的初生重，提高促进肌肉发育相关基因的表达，降低抑制肌肉发育相关基因的表达，并提高免疫力[13-14]；还能优化新生羔羊小肠发育相关基因的表达，使新生羔羊小肠发育获得先天优势[15]，并且三羔较双羔对母体叶酸添加更敏感。因为胎儿获得的营养全部由胎盘通过血管运输，推测叶酸可能通过影响胎盘发育和脐带血管生成相关基因[血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)[12,16-17]、转换生长因子-β3(transforming growth factor-beta 3，TGF-β3)[18-22]、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANGPT-1)[8,23-24]]以及脐带血管内皮生长因子受体基因[血管内皮生长因子受体-1(fms related tyrosine kinase-1，FLT-1)、血管内皮生长因子受体-2(kinase-inserted domain containing receptor，KDR)[25-27]]等参与调控血管生成的关键基因的表达，从而导致营养物质的运输和供给差异，最终影响不同出生类型新生羔羊的初生重。因此，本试验旨在研究妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管生成相关基因VEGFA、TGF-β3、ANGPT-1、FLT-1和KDR表达的影响，为妊娠母羊饲粮添加叶酸影响不同出生类型新生羔羊脐带血管生成提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲粮

试验于2017年5—12月在江苏省乾宝牧业有限公司进行，提前对羊舍消毒。选用体重相近、年龄一致的经产湖羊母羊120只，人工授精后随机分为3组，分别饲喂添加0(C)、16(F16)和32 mg/kg DM(F32)叶酸的全混合日粮(TMR)。母羊分娩时记录窝产仔数，从试验中淘汰单胎和四胎出生的羔羊，选择体重相近的新生羔羊根据出生类型和妊娠母羊叶酸添加水平分为6个组。试验设计见表1。

表1 试验设计

试验使用的叶酸为包被叶酸，经前期绵羊瘤胃瘘管半体内试验测得瘤胃通过率约为92.60%，小肠释放率约为85.59%。试验羊单栏饲养，每天07:00和17:00饲喂饲粮，自由饮水。试验饲粮参照NRC(2007)配制，母羊妊娠前期和后期的TMR组成及营养水平如表2、表3所示。

表3 母羊妊娠后期TMR组成及营养水平(干物质基础)

1.2 样品采集

母羊分娩后，收集胎盘，测量并记录胎盘重量、子叶数；用生理盐水去除胎盘血渍，剥离胎盘子叶，经生理盐水清洗后，保存胎盘样品于液氮中，收集新生羔羊胎儿端脐带样品保存于液氮中，从6个组中每组随机选取3个样品，共18个脐带样品进行后续测定。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA提取及cDNA合成

选用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspin纤维类组织RNA快速提取试剂盒(RN44)提取脐带总RNA，使用微量核酸蛋白检测仪NanoDrop2000分光光度计(Thermo Fisher，美国)测定RNA的浓度和纯度并用琼脂糖凝胶电泳检验其质量。对提取的总RNA选用诺唯赞生物的HiScript III 1st Strand Cdna Synthesis Kit试剂盒(R312-01)，建立20 μL、500 ng体系反转录合成第1链cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.2 血管生成相关基因的引物设计及实时荧光定量PCR检测

参考文献[18,28-29]及NCBI设计目标基因引物序列，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，委托北京擎科生物科技有限公司进行引物合成，目标基因引物序列信息如表4所示。

表4 引物序列信息

使用LineGene 964 BIOER荧光定量PCR检测系统(杭州博日科技有限公司)进行实时荧光定量PCR，选用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂(SYBR Green，FP205)，建立20 μL反应体系，包括：10 μL 2×SuperReal PreMix Plus，正向、反向引物各0.6 μL，1 μL cDNA模板，RNase free ddH2O补齐至20 μL。采用两步法进行扩增，PCR反应程序为：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环，收集荧光信号。

试验中每个模板每个基因做3个技术重复，结果取平均值，采用相对定量法分析数据，采用2-△△Ct法[30-31]计算目的基因在样本中的相对表达水平，其中：

△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因；△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)-(Ct目的基因平均值-Ct内参基因平均值)。

1.4 统计分析

应用Excel 2016整理相关数据，导入SPSS 21.0软件，用GLM进行主效应(出生类型和叶酸添加水平)分析，并用Duncan氏法进行多重比较检验，结果以平均值表示。使用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊胎盘发育的影响

如表5所示，妊娠母羊饲粮添加叶酸对胎盘重、子叶数、胎盘效率均无显著影响(P>0.05)。

表5 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊胎盘发育的影响

2.2 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管生成相关基因表达的影响

如表6所示，妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带VEGFA基因的相对表达水平有显著影响(P<0.05)，但对TGF-β3、ANGPT-1基因的相对表达水平无显著影响(P>0.05)。0 mg/kg DM叶酸添加水平组的新生羔羊脐带VEGFA基因的相对表达水平显著低于16、32 mg/kg DM叶酸添加水平组(P<0.05)。三羔组的新生羔羊脐带ANGPT-1基因的相对表达水平显著高于双羔组(P<0.05)。各基因的相对表达水平分析中，妊娠母羊饲粮叶酸添加水平和出生类型交互作用不显著(P>0.05)。

表6 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管生成相关基因表达的影响

2.3 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管内皮生长因子受体基因表达的影响

如表7所示，妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带FLT-1、KDR基因的相对表达水平无显著影响(P>0.05)。各基因的相对表达水平分析中，妊娠母羊饲粮叶酸添加水平和出生类型交互作用不显著(P>0.05)。

表7 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管内皮生长因子受体基因表达的影响

3 讨 论

3.1 妊娠母羊饲粮添加叶酸对胎盘发育的影响

胎盘重指在分娩结束后排出的胎盘重量，子叶数指胎盘上的子叶个数[32]，胎盘效率这一概念由Wilson等[33]首次在猪上提出，即初生窝重与胎盘重的比值，被认为是子宫容量的指标。对猪[34]、萨福克羊[35]的相关研究发现，窝产仔数与胎盘效率密切相关，且产仔数越多胎盘效率越高。但也有研究表明，随着产仔数的增加，绵羊的胎盘效率显著降低[36]。前期研究发现，妊娠母羊饲粮添加叶酸可以显著增加新生羔羊初生重[13-14]，但在本试验中，妊娠母羊饲粮叶酸添加水平和出生类型对胎盘重、子叶数、胎盘效率均无显著影响，这可能是由于物种或品种差异造成的研究结果不统一，还需要进一步研究。虽然各组胎盘重均值不同，但胎盘的发育程度是有限的，而湖羊相比萨福克羊体型较小，体重较轻，胎盘的生长发育可能不会随着胎儿数增多而持续增长。

3.2 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管生成相关基因表达的影响

血管内皮生长因子促进血管内皮细胞的分裂和迁移，主要调控血管生成，妊娠期间由胎盘组织产生并参与血管生成[16]。其中VEGFA作为血管形成和功能的主要调节因子，在血管生成和内皮细胞生长中起作用，能诱导血管通透性等，在胚胎发育过程不可或缺[12]。比如在兔后肢缺血模型中，添加VEGFA能通过促进血管生成刺激血流灌注[37]；向糖尿病大鼠胚胎添加叶酸，检测到VEGFA基因的相对表达水平增加，促进血管生成以及血管形态正常化[17]；而在宫内生长迟缓猪胎盘中，VEGF基因的相对表达水平显著降低[38]。这说明组织中VEGFA基因的相对表达水平增加可以促进血管生成，发生在胎盘中时可能影响营养运输。本试验中，妊娠母羊饲粮添加叶酸显著提高了VEGFA基因的相对表达水平，说明妊娠母羊补充叶酸可以可能促进了脐带血管生成，影响母体和胎儿间的营养物质运输。

TGF-β3同样具有调节血管系统的作用，可调节细胞生长过程和血管生成，是重要的内源性微血管生成调节因子[19]。在人和小鼠上的研究表明，TGF-β缺失时可能因为血管缺陷而具有胚胎致死性[20]。向体外培养牛和大鼠血管内皮细胞中添加TGF-β3时，可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成[21]；在大鼠的脂肪干细胞和卵巢的自体移植中，检测到TGF-β3基因的相对表达水平上升，血管密度增加[18,22]。但本试验中，妊娠母羊饲粮添加叶酸和出生类型对TGF-β3基因的相对表达水平均无显著影响，可能由于体内试验与细胞试验的内环境存在较大差异造成的。

ANGPT-1可以与血管内皮生长因子协同作用并增强其作用，诱导系统发育健全和稳定进行血管生成[23]。ANGPT-1对脉管系统成熟和重塑非常重要，缺乏时会引发功能不全[24]，胚胎缺乏ANGPT-1表现出心血管缺陷并在妊娠中期死亡[8]。ANGPT-1和血管生成素-2(angiopoietin-2，ANGPT-2)都是在胎盘中表达的血管生成生长因子，它们竞争相同受体——内膜内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)；前者是Tie-2受体的主要激动剂，后者则有可能是Tie-2的拮抗剂或部分激动剂[24]。本试验中，妊娠母羊饲粮添加叶酸对ANGPT-1基因的相对表达水平无显著影响，推测ANGPT-1会与ANGPT-2竞争Tie-2受体[23]，引起三者表达的变化，还需结合ANGPT-2和Tie-2基因的相对表达水平作进一步研究分析；但三羔组脐带ANGPT-1基因的相对表达水平显著高于双羔组，可能有利于多羔脐带血管生成，说明不同出生类型可能影响胎盘脐带向胎儿运输更多营养物质。

3.3 妊娠母羊饲粮添加叶酸对不同出生类型新生羔羊脐带血管内皮生长因子受体基因表达的影响

血管发育过程中，血管内皮生长因子主要通过与FLT-1和KDR结合发挥生理作用[37]。FLT-1主要在胚胎发育过程中作为VEGFA功能的负调控因子，降低VEGFA对KDR的可用性，防止信号过度转导[12]，可溶性FLT-1可以与血管内皮生长因子结合并抑制其活性[9]。而KDR作为血管内皮生长因子的主要受体，主要介导内皮细胞增殖，从而提高血管通透性[25-26]，仅激活KDR就足以激活参与有丝分裂和细胞迁移的信号转导因子，也可以通过封闭KDR抑制血管内皮生长因子活性，影响内皮细胞增殖[27]。本试验中，妊娠母羊饲粮添加叶酸和出生类型对FLT-1、KDR基因的相对表达水平均无显著影响，与前人关于小鼠病理性血管模型中FLT-1、KDR基因的相对表达水平上调的研究结果[25]不一致，可能是因为叶酸添加水平或者物种差异引起的。但无论是双羔还是三羔，16、32 mg/kg DM叶酸添加水平组FLT-1基因的相对表达水平与0 mg/kg DM叶酸添加水平组相比有下降的趋势，与VEGFA基因表达的变化趋势相反，因为FLT-1负调控血管内皮生长因子功能，推测随着FLT-1基因的相对表达水平下降，VEGFA能更大程度上发挥其促进血管生成的生理功能。

4 结 论

妊娠母羊饲粮添加叶酸对胎盘发育没有显著影响，但是显著提高了新生羔羊脐带VEGFA基因的相对表达水平，有利于新生羔羊脐带血管生成。同时，新生羔羊三羔脐带ANGPT-1基因的相对表达水平显著高于双羔，有利于多羔脐带血管生成。