异土木香内酯对人舌鳞癌Tca8113细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

王明波

(锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)

舌鳞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占口腔癌 1/3～1/2，临床治疗主要以手术治疗为主，以放疗及化疗为辅[1-3]。由于舌的淋巴管及血运丰富，并且舌的活动频繁，舌癌极易发生区域淋巴结及远处转移，手术不易完全清除。化疗可在一定程度上控制肿瘤的负荷量，但舌癌对化疗及放疗敏感性差，导致化疗效果不佳，从而引起肿瘤的复发及转移[4-5]。异土木香内酯来源于菊科旋覆花属植物土木香的干燥根，属多年生草本植物。异土木香内酯(isoalantolactone，IAL)是从土木香中提取的半萜烯内酯类小分子化合物。研究表明，异土木香内酯能抗真菌和细菌的作用，能够显著抑制金黄色葡萄球菌agr二元调控系统，依赖性地降低金黄色葡萄球菌SEA和SEB的表达[6]。最近研究表明，异土木香内酯也有抗肿瘤的作用，IAL可抑制膀胱癌细胞株T24细胞增殖，促进细胞凋亡[7]。IAL通过上调p38-MAPK来抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭[8]，IAL通过激活p53从而使人肺鳞状癌细胞凋亡[9]。本实验通过研究异土木香内酯对Tca8113细胞增殖、凋亡的影响及其机制，来探讨异土木香内酯对舌癌的治疗可能性。

1 实验材料

舌鳞癌细胞株Tca8113(锦州医科大学附属第一医院外科重点实验室提供)，1640培养基(SoLarbio)，DMEM培养基(soLarbio)，胎牛血清(BIOIND)，胰酶(servicebio)，DMSO(SoLarbio)，CCK-8溶液(瑟欧生物)，EDU试剂盒(锐博生物)，transweLL小室(NEST)，TUNEL凋亡检测试剂盒(塞维尔生物)，96孔板(NEST)，离心管(NEST)。倒置显微(UOPDSY5000X)，酶标仪(BECKman couLter AD340)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

舌癌细胞Tca8113来源于锦州医科大学，在-80 ℃冰箱取出复苏后，在 37 ℃、5%CO2，进行培养。取对数生长期细胞，用PBS洗涤1～2遍，并用2 mL胰蛋白酶加入培养皿中进行消化，将消化好的混悬液1000 rpm条件下离心5 min；按照DMSO∶胎牛血清=1∶9的比例配置细胞冻存液；弃去上清，在离心管中加入冻存液，重悬细胞；通过细胞计数调整悬液浓度，吸取1～1.5 mL悬液，移至冻存管中，做好标记；将冻存管依次放入4 ℃、-20 ℃冰箱各30 min，再放入液氮内的冻存盒里冻存。

2.2 异土木香内酯作用于Tca8113细胞的IC50值

将用DMSO稀释成10、20、40、80、120、160 μM的溶液待用，实验组为不同浓度的异土木香内酯溶液，对照组为DMSO稀释液，将预先制备好的细胞悬液按每孔100 μL加入96孔培养板，(每组6个复孔)，然后将培养板在培养箱预培养24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，从培养箱里取出培养板，每孔加入10 μL不同浓度异土木香内酯溶液和DMSO稀释液继续培养，48 h后，采用CCK8试剂盒进行检测，用酶标仪测定在450 nm处的每个孔的吸光值，记录测量值，测算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)]×100 %。

2.3 应用CCK8法检测异土木香内酯对TCA8113细胞增殖能力的影响

实验分为对照组合实验组，实验组为20 μM的异土木香内酯DMSO稀释溶液，对照为DMSO稀释液。将预先制备好的细胞悬液按每孔100 μL加入96孔培养板，(每组不少于5个复孔)，然后将培养板在培养箱预培养24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，从培养箱里取出培养板，每孔加入 10 μL 待测物质后放回培养箱持续孵育。分别在0、12、24、36 h，从培养箱里取出培养板，再向每孔加入10 μL CCK8工作液。再次放回培养箱孵育1～2 h，后拿出培养板用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。并记录实验数据。

2.4 EDU法检测异土木香内酯对Tca8113细胞增值力的影响

将预先制备好的细胞悬液按每孔100 μL加入96孔培养板，分为两组，每组2个复孔，实验组为20 μM的异土木香内酯DMSO稀释溶液，对照为DMSO稀释液。首先将培养板在培养箱，37 ℃，5% CO2，培养至正常生长状态。然后配制适量的EDU试剂，并进标记，经固定染色后，在荧光显微镜下，观察细胞颜色并拍照，紫外光下，细胞核全染为蓝色，绿光下增殖细胞核染为红色。

2.5 细胞划痕实验检测异土木香内酯对Tca8113细胞迁移能力影响实验

实验仍分为两组，每组2个重复，实验组为20 μM的异土木香内酯DMSO稀释溶液，对照为DMSO稀释液。将Tca8113细胞接种于6孔板中，过夜培养，铺满底部。第2天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37 ℃ 5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24 h，分别对实验组和对照组进行拍照，并记录划痕位置及宽度。用Photoshop软件计算划痕前后细胞之间空白处面积差(单位：像素)，取平均值，计算迁移率。迁移率=(划痕0 h空白处面积-划痕后 24 h空白处面积)/划痕0 h空白处面积。

2.6 Transwell 侵袭实验检测异土木香内酯对Tca8113细胞侵袭能力影响实验

实验仍分为两组，每组2个重复，实验组为20 μM的异土木香内酯DMSO稀释溶液，对照为DMSO稀释液。在培养瓶中加入胰酶进行消化，调整细胞至合适密度观察计数。24孔板中，在下室加入400 μL完全培养基，上室加入不含血清的细胞悬液200 μL，然后置于培养箱中培养，培养24 h后，用多聚甲醛固定25 min，生理盐水清洗3次，加入结晶紫进行染色40 min，在显微镜下比较两者之间的差异性，记录测量值，利用GraphPad软件辅助分析实验结果。

2.7 Tunel实验异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡的影响

实验仍分为两组，每组2个重复，实验组为20 μM的异土木香内酯DMSO稀释溶液，对照为 DMSO稀释液。在24孔板上培养贴壁细胞。按照TμNEL凋亡检测试剂盒说明书进行检测。处理好的样本立即在荧光显微镜下分析拍照，载玻片注意避光。DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色，只在凋亡的细胞核中才有CF640-dUTP掺入而定位的绿色荧光。

2.8 Western Blot检测相关蛋白表达的影响

准备4组对数生长期的Tca8113细胞，每瓶细胞数基本保持一致，实验设置实验组、对照组和空白对照组。实验组：配制10 μM和20 μM的异土木香内酯溶液，将配置好的异土木香内酯溶液分别接种Tca8113细胞；同时以 0.5% DMSO 处理组作为对照浓度；空白对照组为不做任何处理的Tca8113细胞。分别提取总蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，经采用SDS-PAGE电泳、转印、染色照相后。分别检测舌癌细胞Tca8113的GAPDH内参蛋白，Caspase3、Bcl-2蛋白的表达水平，来检测异土木香内酯对舌癌细胞的作用。

3 实验结果

3.1 异土木香内酯作用于Tca8113细胞的IC50值

经检测，对照组、10、20、40、80、120、160 μM组的平均吸光值分别为0.451、0.285、0.224、0.235、0.221、0.235和0.274。通过与对照组比较计算，得出即 IC50值为20 μM。在后续实验中，异土木香内酯的作用浓度均为 20 μM，见图1。

图1 不同浓度异土木香内酯作用于Tca8113细胞的OD值

3.2 异土木香内酯对Tca8113细胞活力影响实验结果

通过CCK-8法检测20 μM异土木香内酯在36 h内对Tca8113细胞活性的影响，经检测，随着时间增加，实验组的Tca8113细胞活性逐渐降低，见图2。

*P<0.05

3.3 异土木香内酯对 Tca8113 细胞克隆形成能力影响实验

实验结果显示，在7 d内，与对照组相比，实验组的克隆数明显减少。20 μM异土木香内酯对Tca8113细胞增殖能力具有明显的抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图3。

***P<0.001

3.4 异土木香内酯对Tca8113细胞增殖力影响实验

EDU实验检测证明：实验组与对照组相比增殖能力明显减弱，以P<0.01为差异有统计学意义。以上结果提示，20 μM异土木香内酯对Tca8113细胞增殖能力具有抑制作用，见图4。

**P<0.01

3.5 异土木香内酯对Tca8113 细胞迁移能力影响实验结果

划痕实验结果显示，实验组与对照组相比，Tca8113细胞爬行距离变小，以P<0.01为差异有统计学意义，表明细胞迁移能力明显减小，见图5，迁移率见表1。说明20 μM的异土木香内酯对Tca8113细胞迁移能力具有抑制作用。

图5 实验组与对照组划痕实验0 h与24 h比较

表1 实验组与对照组细胞迁移率比较

**P<0.01

3.6 异土木香内酯对Tca8113细胞侵袭能力影响实验结果

Transwell实验表明，实验组与对照组相比，侵袭能力明显减弱，以P<0.01为差异具有统计学意义。如图7所示，表明异土木香内酯对Tca8113细胞侵袭能力具有抑制作用。

3.7 异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡影响实验结果

Tunel实验结果显示，实验组与对照组相比，Tca8113细胞凋亡明显增多，以P<0.01为差异有统计学意义。结果表明20 μM异土木香内酯对Tca8113细胞凋亡具有促进作用，见图8。

**P<0.01

**P<0.01

3.8 Western Blot

结果表明，不同处理组的内参蛋白GAPDH的表达水平无差异，表明其几乎不受其他因素影响，可以作为内参得到每个样品的相对含量。与对照组相比，异土木香内酯组的抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，而促凋亡蛋白Caspase-3活性水平均显著增加，与浓度呈正相关，以P<0.01为差异有统计学意义，见图9。

图9 Western Blot实验结果图

近年来，舌癌的发生率有上升的趋势，且其恶性程度较高，生长快，浸润性强。舌癌晚期波及口底、下颂骨，向后侵及腭舌弓及扁桃体；侵及舌根部或伴继发感染时发生剧烈疼痛。对于恶性舌癌的治疗以手术为主联合其他治疗方法，根据患者的具体情况来实施治疗方案。一般来说，手术切除原发病灶，手术解决的是局部病灶及手术可涉及范围内的病灶，但对于已有远处转移病例的治疗或在预防复发方面是无能为力的，这时依靠化学药物治疗或生物治疗具有一定的疗效。另外，利用中药治疗配合手术治疗、放射治疗和化学治疗可起到很好的治疗效果，因为中药治疗能提高免疫功能，从而起到提高和巩固疗效的作用。已有研究经证实，有数百种中药材具有抑制肿瘤癌细胞生长的作用，诸如百安、参阳、苗蓝、黄寄素、清瘤亮喉等在体外实验研究、治疗或辅助治疗口腔鳞癌中，均显示出了明显的杀肿瘤作用[10-13]。本研究对异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞的影响及其可能的产生调节作用的机制进行了探讨，本研究中采用CCK-8法测出异土木香内酯对Tca8113细胞 IC50值为20 μM，且在36 h内，异土木香内酯对Tca8113细胞活性具有明显的抑制作用。已有研究表明异土木香内酯对膀胱癌T24细胞的IC50值为22.45 μmol/L[14]。通过EDU实验发现，20 μM的异土木香内酯可以抑制舌癌Tca8113细胞增殖，这些实验结果说明异土木香内酯可能在治疗舌癌中具有潜在的可能性。癌细胞迁移和侵袭是发生癌转移的基础[15]，本实验中，细胞划痕实验和Transwell实验结果表明0 μM的异土木香内酯可以有效的抑制舌癌Tca8113细胞的迁移和侵袭。Tunnel实验证明其可以诱导Tca8113细胞凋亡。其可能原因是其可以调节细胞的代谢通路。有文献报道，异土木香内酯可以通过上调p38-MAPK诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡[16-18]和抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭[19]，激活p53来诱导人肺鳞状癌细胞凋亡，还有文献报道其通过增加ROS诱导前列腺癌PC3细胞凋亡[20-22]。

综上所述，异土木香内酯对舌癌细胞具有抑制作用，但是其作用机制还需要进步研究。发现其在舌癌临床应用前景及价值。

4 讨 论

本研究对异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞的影响及其可能的产生调节作用的机制进行了探讨。研究中通过CCK8实验，对异土木香内酯的体外药效做了初步研究，以舌癌Tca8113 细胞为研究对象，研究异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞的抑制作用，CCK8结果显示，在孵育时间为24 h内，异土木香内酯对舌癌Tca8113细胞的IC50值为20 μM，在0～20 μM 浓度范围，随着浓度增加，抑制作用增强，但是浓度范围为20～80 μM，抑制作用增强效果不明显。克隆形成实验和EDU实验进一步验证了20 μM 异土木香内酯可以抑制舌癌Tca8113细胞增殖，同时抑制细胞克隆形成。细胞划痕实验和Transwell实验结果表明20 μM的异土木香内酯可以有效的抑制舌癌Tca8113细胞的迁移和侵袭。但具体机制不明确，因此需要进一步的实验研究。本研究中通过Tunnel实验和Western Blot实验证明，异土木香内酯可以诱导Tca8113 细胞凋亡。可能原因是其可以调节细胞的代谢通路。

综上所述，异土木香内酯能抑制舌鳞癌 Tca8113细胞的增殖、迁移侵袭并促进Tca8113细胞凋亡，并呈一定浓度时间依赖性。但具体机制不明确，因此需要进一步的实验研究。