HER2阳性胃癌组织MSI和PD-L1表达及意义

(青岛大学附属医院肿瘤科,山东 青岛 266031)

人表皮生长因子受体2(HER2)阳性的转移性/不可切除胃癌病人预后差，曲妥珠单抗联合化疗是目前标准治疗模式，但该联合方案的生存获益有限。免疫治疗被认为是肿瘤治疗中最具前景的治疗方法，然而其在胃癌中的应用仍不理想，且缺乏筛选有效人群的理想生物标记物。微卫星不稳定性(MSI)及程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平在多种肿瘤中显示出与免疫治疗效果密切相关，但目前关于胃癌病人HER2状态、MSI状态及PD-L1表达情况相关性研究报道较少。本研究旨在验证二代测序(NGS)与免疫组织化学(IHC)技术在胃癌HER2状态评估中的一致性，分析HER2阳性胃癌组织中MSI状态、PD-L1表达与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

使用关键词“胃癌”、“大标本”、“HER2”在青岛大学附属医院病理资料数据库中搜索2013年1月—2017年12月行胃癌手术的病人，共搜索到病人1 390例。所有病人术后大标本均已进行HER2的IHC检测，其中105例病人的组织标本为HER2(3+)，即HER2阳性，选取92例术前未行放化疗的HER2阳性胃癌病人纳入本研究。入组的92例病人中，男性75例，女性17例；年龄35～87岁，中位年龄64岁；AJCC第8版分期Ⅰ期11例，Ⅱ期32例，Ⅲ期41例，Ⅳ期8例；Lauren分型肠型58例，弥漫型12例，混合型21例；腺癌82例，黏液腺癌5例，印戒细胞癌5例；高分化2例，中分化39例，低分化51例。

1.2 NGS检测HER2基因有无扩增及MSI状态

1.2.1组织DNA提取 石蜡组织切片行脱蜡、刮片、消化、升温、离心等处理，收集洗脱液于无菌离心管中，进行NGS检测。

1.2.2文库构建 先将基因组DNA进行超声片段化处理，然后进行末端修复、3′端加A、添加接头以及PCR扩增，得到预文库。预文库在探针作用下进行16～24 h的杂交，抓取出检测所需的目的片段，最后给靶序列加上测序所需的分子标签，完成文库构建。

1.2.3基因测序 使用IlluminaNextseq 500/550测序仪以快速模式进行大规模平行测序。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，用光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机软件将光学信号转化为测序碱基。

1.2.4数据分析 NGS检测会产生大量的原始序列数据，将原始序列数据进行初级处理，过滤后得到clean data(删除质量不好的原始数据后得到的数据，常见的删除方法有去接头、去N含量高及质量评分较低的原始数据等)。对clean data进行序列比对并捕捉基因点突变、缺失、插入、拷贝数变化、结构变异等多种变异信息，并注释。用SPSS 22.0软件进行结果分析。

1.3 IHC检测PD-L1蛋白表达

应用22C3抗体浓缩物在Dako ASL48自动染色仪中对组织标本进行染色，将染色结果与Dako ASL48平台上的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒进行比对以评估PD-L1表达。IHC检测均设阳性对照和阴性对照。

1.4 检测结果判定

1.4.1HER2基因扩增及MSI状态 ①HER2基因扩增：拷贝数/细胞2.75～3.00，且一个基因60%以上的探针捕获区域(bin)在癌症样本中的覆盖深度显著高于基线水平，同时整个基因区域的覆盖水平与基线水平差异具有统计学意义。②MSI状态：40%以上MSI基因座(loci)长度不稳定，则认为是微卫星高度不稳定(MSI-H)；小于15% MSI loci长度不稳定，则认为是微卫星稳定(MSS)；如果长度不稳定的MSI loci在15%～40%之间，则认为是微卫星低度不稳定(MSI-L)。

1.4.2PD-L1表达阳性 ①组合阳性评分(CPS)：PD-L1染色细胞(包括肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)的数量除以活肿瘤细胞总数再乘以100。如果CPS≥1，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。②肿瘤比例评分(TPS)：相对于样品中存在的所有肿瘤细胞中PD-L1阳性细胞(具有(1+)～(3+)强度的全部或部分细胞膜染色的活肿瘤细胞)的百分比。如果TPS≥1%，则认为该病人存在PD-L1过表达，即PD-L1表达阳性。

1.5 统计分析

用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 HER2基因扩增情况

本研究IHC检测HER2(3+)胃癌病人92例，61NGS检测显示84例病人存在HER2基因扩增，8例病人未显示HER2基因扩增，IHC与NGS检测结果的一致性为91.3%。HER2基因扩增病人中合并HER2基因错义突变者10例(10.7%)，合并基因融合者17例(20.7%)，同时合并基因错义突变与基因融合者1例(1.1%)。

2.2 MSI状态与HER2基因扩增的关系

本文研究92例HER2阳性胃癌病人中，MSS病人90例(97.8%)，MSI-H病人2例(2.2%)，84例发生HER2基因扩增的病人均呈MSS状态，无MSI-H病人，HER2基因扩增与MSI-H可能存在互斥关系。

2.3 CPS标准下HER2阳性胃癌组织中PD-L1表达与临床病理特征的关系

本研究92例HER2阳性胃癌病人PD-L1阳性率为89%，其中CPS≥5者占81.5%，CPS≥10者占55.0%。在该评分标准下，PD-L1表达与病人的临床病理特征无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 CPS标准下HER2阳性胃癌组织PD-L1表达与临床病理特征的相关性(例)

2.4 TPS标准下HER2阳性胃癌组织中PD-L1表达与临床病理特征的关系

本研究92例HER2阳性胃癌病人PD-L1阳性率为24%，无PD-L1表达超过50%的病人。在该评分标准下，PD-L1表达与病人的临床病理特征无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 TPS标准下HER2阳性胃癌组织PD-L1表达与临床病理特征的相关性(例)

3 讨 论

目前，HER2受体是胃癌靶向治疗最为有效靶点，其过表达主要由HER2基因扩增导致，临床常用检测方法为IHC和荧光原位杂交(FISH)，阳性标准是HER2 IHC(3+)或IHC(2+)/FISH+。各国家/地区的HER2阳性胃癌发病率存在差异，为7%～34%，两项针对中国人群的研究结果分别为13%和12%[1-2]。本研究共检索到青岛大学附属医院2013年1月—2017年12月行胃癌手术且行HER2 IHC检测病人1 390例，其中HER2(3+)胃癌病人105例，HER2(2+)胃癌病人53例，阳性率为7.5%。此结果与我国既往报道的研究数据差异较大，考虑主要原因是IHC检测HER2(2+)者未采用FISH检测进一步验证和数据搜索时出现信息偏倚。ROSS等[3]研究表明，在乳癌和胃癌中采用NGS技术确定HER2状态是可行的，尤其是针对IHC或者FISH评价中模棱两可的病例具有明显优势。JANJIGIAN等[4]研究显示，对于评估胃癌组织HER2阳性状态，IHC/FISH和NGS的一致率为93.7%。在本研究中，IHC检测HER2(3+)病人共92例，NGS检测84例发生HER2基因扩增，两者一致率为91.3%，与上述研究结果基本一致，提示NGS检测可以作为胃癌HER2状态评估的方法之一。

有研究结果显示，MSI-H在胃癌中的发生频率为5.6%～33.3%，但是并无研究报道其在HER2阳性胃癌中的发生频率[5]。癌症基因组图谱(TCGA)数据显示，MSI-H的胃癌病人占21.7%，该亚型具有高突变率，但是缺乏HER2等常见基因的扩增结果[6]。亚洲癌症研究小组(ACRG)的研究结果显示，61例MSI胃癌病人均未见HER2基因扩增，在MSS胃癌病人中HER2基因扩增更常见。本研究中，92例HER2阳性胃癌病人中有MSI-H胃癌病人2例(2.2%)，但是发生HER2基因扩增的84例胃癌病人均表现为MSS，未发现MSI-H病人，结合TCGA、ACRG研究结果，我们认为HER2基因扩增与MSI-H之间可能存在互斥关系。当然，这需要进一步分子研究证实。

对于应用于胃癌中计算PD-L1表达量的两种方法，TPS已被证实不能有效预测病人对免疫药物的治疗反应，而CPS则具有良好的预测作用及可重复性。这两者的区别在于CPS不只反映肿瘤细胞中PD-L1的表达，同时还反映了免疫细胞中PD-L1的表达。既往研究显示，胃癌组织中PD-L1过表达与浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、血管侵犯、EB病毒感染、MSI状态等显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、Lauren分型、TNM分期、淋巴管侵犯、神经浸润等无明显关系[7]。而本研究结果显示，无论在TPS还是在CPS标准下，PD-L1过表达与HER2阳性胃癌病人的性别、年龄、肿瘤部位、术后分期、T分期、N分期、血管浸润、神经侵犯、分化程度等均无明显关系。本研究中CPS标准下HER2阳性胃癌病人PD-L1的阳性率为89%，明显高于以往报道的胃癌组织PD-L1阳性率。根据公式CPS=TPS+MIDS(免疫细胞PD-L1染色阳性的比例)[8]，可以大体估算HER2阳性胃癌组织中免疫细胞PD-L1阳性率约为65%，而THOMPSON等[9]报道胃癌组织中浸润免疫细胞的PD-L1阳性率为44%，可以看出HER2阳性胃癌组织免疫细胞上有更多的PD-L1表达。有研究表明，HER2受体过表达可促进胃癌细胞上PD-L1的表达；进一步研究发现，抑制HER2信号转导途径中PI3K-AKT-mTOR通路可降低发生HER2蛋白过表达的胃癌细胞上PD-L1的表达[10-11]。上述研究在不同方面解释了本研究中HER2阳性胃癌组织中PD-L1阳性率较高的原因。

KEYNOTE-061Ⅲ期临床试验的阴性结果宣告了免疫治疗在胃癌二线治疗中的失败，但亚组分析显示，在PD-L1 CPS≥10的病人中，帕博利珠单抗对比紫杉醇化疗观察到了总生存期(OS)获益的趋势(17.4 vs 10.8个月)[12]。本研究中，HER2阳性胃癌病人具有更高的PD-L1阳性率，其中CPS≥10的病人占55.0%，这提示HER2阳性胃癌病人更有可能在免疫治疗中获益。另外，临床前研究显示，抗程序性死亡受体1(PD-1)单抗联合抗HER2治疗存在协同作用，曲妥珠单抗可以刺激HER2特异性的T细胞反应，增加肿瘤细胞的PD-L1表达，而抗PD-1单抗可以增强曲妥珠单抗的T细胞特异性免疫[13-14]。2019年ASCO年会报道一项Ⅱ期临床研究结果显示，曲妥珠单抗联合化疗、帕博丽珠单抗治疗HER2阳性胃癌客观缓解率(ORR)达到87%，疾病控制率(DCR)高达100%，12个月的总生存率为76%，该研究证实了HER2阳性胃癌靶向治疗与免疫治疗联合治疗方案的应用价值[15]。

综上所述，IHC和NGS技术检测胃癌组织中HER2表达的一致率较高，NGS技术检测评估胃癌HER2状态具有潜在价值；胃癌组织中HER2基因扩增与MSI-H可能存在互斥关系；HER2阳性胃癌CPS标准下的PD-L1阳性率高于TPS标准下的PD-L1阳性率，但二者均与临床病理特征无关。本研究的不足之处是缺乏HER2阴性胃癌病例作为对照，故本研究结果仍需要进一步的研究证实。