施氮水平对富士苹果果实钙形态及品质的影响

张艳珍，程存刚，赵德英，周江涛，陈艳辉，张海棠，解 斌

（中国农业科学院果树研究所/辽宁省落叶果树矿质营养与肥料高效利用重点实验室/农业农村部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100）

‘富士’苹果作为我国的主栽品种，其栽培面积约占我国苹果种植面积的70%以上[1]。近些年随着人民生活水平的日益提高，人们对苹果果实品质的要求也越来越高[2]。钙在果实品质形成过程中起重要作用，甚至超过了氮、磷、钾等元素[3]。大量研究表明，果实内适量的钙含量能提高果实硬度、果实总糖和维生素C含量，同时降低果实可滴定酸含量[4-7]。果实中钙含量不足，会增大果实生理失调 (苦痘病、水心病等) 发生几率[8-10]。钙在果实内主要以水溶性钙、果胶酸钙、磷酸钙、草酸钙和残渣钙的形式存在[11]。果实品质的形成与保持不仅与果实总钙含量有关，还与不同形态钙含量有关[12-13]。不同形态的钙在植物体内具有不同的功能，且在一定的生理环境条件下可相互转化[14]。

氮是植物需求量最大的必需营养元素之一。氮可影响钙的吸收，从而改变果实内钙含量，影响果实品质[15]。供氮不足或过量均会影响果树对钙的吸收[8]，降低果实品质[16]。有研究表明，供氮不足导致果实内钙含量减少，果实品质变差；氮肥过多时，钙离子和铵离子产生拮抗作用，阻碍钙离子正常吸收[17-18]。前人研究主要集中在钙肥种类[19-20]、施钙方式[21-22]、施钙量和施钙时期[23]对果实品质及不同形态钙的影响方面，而施氮量对富士苹果果实内不同形态钙的影响，以及各形态钙在果实品质形成中的作用研究较少。

因此，研究不同施氮量下富士苹果果实内各形态钙的变化趋势，及其与果实品质指标变化的相关性，明确不同形态钙对果实品质的影响程度及影响方式，以便通过调整氮肥施用量，调控果实中某种形态钙的比例，实现改善果实品质的目的，进而为苹果氮肥合理施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年4—12月在中国农业科学院果树研究所进行。以5年生盆栽富士 (Malus domesticaBorkh cv. Fuji) 为试材，基砧为组培山定子，中间砧为SH38，每株果25个左右。营养钵尺寸为上口径36 cm、下口径 32 cm、高 29 cm，土壤重量 30 kg。土壤pH为7.1、有机质含量11.5 g/kg、碱解氮含量86.3 mg/kg、有效磷含量 57.5 mg/kg、速效钾含量138.7 mg/kg。

1.2 试验设计

试验共设置6个施氮 (N) 水平，分别为0、50、100、200、300、400 kg/hm2，折合每盆尿素用量分别为 0、1.48、2.96、5.93、8.89 和 11.86 g，依次记为 N0、N50、N100、N200、N300和 N400处理。同时按施钙 (Ca) 200 kg/hm2计，折合无水氯化钙为每盆 7.58 g。所用氮肥为尿素 (N 46%)，钙肥为无水氯化钙 (分析纯)。每个处理选取长势一致的植株6株，单株小区，6次重复。肥料等分为3次施入，花后7天开始施肥，每7天施1次。肥料溶于1 L水中，采用施肥袋进行施肥，滴速为250 mL/h。其他管理水平为常规管理。

1.3 样品采集及测定

1.3.1 样品采集与处理 果实成熟期，每个处理随机采集树冠外围中部，大小均匀的果实50个。将10个果实洗净切片混匀，105℃杀青30 min，70℃烘干至恒重，粉碎后过80目筛于自封袋保存，用于总钙含量测定；将10个果取皮下果肉，经液氮冷冻后于-80℃冰箱中保存，用于测定不同形态钙；另外30个果实则10个果为一个重复，测定果实品质。

1.3.2 果实钙含量测定 样品经H2O2-H2SO4法[24]消煮后，用原子吸收分光光度计 (ZEEnit700P，德国)测定总钙含量。根据总钙含量 (FW)/(1 – 果实含水量) = 总钙含量 (DW)，计算果实总钙含量 (FW)。

采用逐级提取法提取[25]果实中各形态钙，浸提液依次为去离子水、1 mol/L NaCl、2% HAc 和 5%HCl，提取液的主要组分分别为水溶性钙 (H2O-Ca)、果胶酸钙 (NaCl-Ca)、磷酸钙 (HAc-Ca)、草酸钙(HCl-Ca)。原子吸收分光光度计测定各提取液中钙含量。

1.3.3 果实品质测定 于果实成熟期采样，每个处理随机采集树冠外围中部大小均匀的果实30个，10个果为一个重复，共3次重复。用色差仪 (NR145，中国) 测量果皮的色泽参数。用IP67型数显卡尺测量果实纵横径，果形指数用果实纵径与横径的比值表示。使用TA-HDplus物性分析仪测定果实硬度；使用PAL-1手持测糖仪测定可溶性固形物含量；采用酸碱滴定法测定可滴定酸含量，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，采用2,6-二氯靛酚滴定法测定维生素C含量。

1.4 数据处理及统计分析

使用 Microsoft Excel 2016 软件进行数据处理，使用SAS 9.4进行方差分析和相关性分析。

2009年，微量物质示踪技术在绥中油田[14]进行了应用，现场试验表明微量物质示踪剂具有用量少、检测精度高、对环境无污染等优点。随后大港油田[15]也取得了良好的现场使用效果。

广义线性模型 (generalized linear model，GLM)可以应用于非线性或非恒定方差结果的数据中，因此参照丛金鑫[26]的方法，采用R3.6.3软件平台，通过广义线性模型 (GLM) 建立不同形态钙与果实品质指标之间的关系，使用矫正的AIC进行模型检验，选出最佳拟合模型，同时通过MuMIn程序包的dregre函数，分析不同形态钙对果实品质指标的影响程度及影响方式。

2 结果与分析

2.1 施氮量对果实总钙及不同形态钙含量的影响

施氮可显著影响果实钙含量及各形态钙的组成比例(表1）。富士苹果果实中总钙含量随施氮量的增加呈先升高后降低的趋势，N200处理果实总钙含量显著高于其他处理和对照，但N300与N400处理之间无显著差异。施氮量由低到高各施氮处理的总钙含量比N0分别增加了21.02%、59.14%、73.47%、42.99%和41.60%。施氮可增加果实中水溶性钙(H2O-Ca)、果胶酸钙 (NaCl-Ca)、磷酸钙 (HAc-Ca) 含量。除N50处理的H2O-Ca和N400处理的草酸钙 (HCl-Ca) 外，各施氮处理果实中的4种形态钙均与N0之间存在显著差异。H2O-Ca、NaCl-Ca、HAc-Ca和HCl-Ca分别在N400、N200、N100、N200处理时含量最高，比对照N0处理分别增加了138.31%、87.25%、34.49%、59.35%。

表1 不同施氮水平下果实总钙及不同形态钙含量 (mg/kg, FW)Table 1 Total Ca and different forms of Ca content of fruits at different nitrogen levels

随施氮量的增加，果实中不同形态钙的组成比例发生了变化，其中H2O-Ca、NaCl-Ca、HAc-Ca变化幅度较大 (图1)。H2O-Ca随施氮量的增加比例整体呈上升趋势，在N400处理中占果实中总钙含量的44.13%，比N0处理中的占比增加了15.70%，在N200处理中占果实中总钙含量的32.58%，比N0处理中的占比增加了6.95%；NaCl-Ca随施氮量的增加变化趋势不明显，在N50与N200处理时分别占果实中总钙含量的43.15%和42.88%，分别比N0处理中占比增加了3.43%和3.15%；HAc-Ca所占比例随施氮量的增加呈先降低后升高趋势，在N200处理时占比最小，为果实中总钙含量的12.03%；HCl-Ca和残余钙(Res-Ca) 变化范围较小，占果实中总钙含量的比例分别为5%～8%和4%～7%。

图1 不同施氮水平下果实中不同形态钙的组成比例Fig. 1 Proportions of different forms of calcium in fruit at different nitrogen levels

2.2 不同施氮量下富士苹果果实中不同形态钙之间的关系

图2右上方为总钙含量和其余钙含量的相关系数，左下方为一种钙形态的钙含量随其余钙的增加而呈现的增加或者减少情况。图2显示，果实中4种形态钙均与总钙含量呈正相关，其中H2O-Ca、NaCl-Ca与总钙 (Total-Ca) 含量呈极显著正相关，相关系数分别为0.85和0.86，HCl-Ca与Total-Ca含量呈显著相关，相关系数为0.63。不同形态钙之间也存在一定的相关性，表现为：NaCl-Ca与HCl-Ca的含量呈极显著正相关，相关系数达0.74；H2O-Ca与NaCl-Ca、HAc-Ca和HCl-Ca均呈正相关，相关系数分别为0.46、0.07和0.32。而HAc-Ca与HCl-Ca呈负相关，相关系数为–0.066。

图2 不同施氮水平下果实中不同形态钙的相关系数及分布关系Fig. 2 Correlation coefficients and distribution of different forms of calcium in fruit at different nitrogen levels

c通过果实内不同形态钙的分布图可以发现，随着H2O-Ca含量的增加，其他3种形态钙均呈先上升后下降的趋势。H2O-Ca含量为35 mg/kg时，其他3种形态钙含量均最高，随H2O-Ca继续增加，其他形态钙含量均出现明显下降趋势。HAc-Ca含量随NaCl-Ca含量的增加呈先上升后下降的趋势，NaCl-Ca含量为40 mg/kg时，HAc-Ca含量最高，随NaCl-Ca含量继续增加，HAc-Ca含量明显下降；HCl-Ca含量随NaCl-Ca含量的增加呈先上升后下降的趋势，当NaCl-Ca含量为30～35 mg/kg时，HCl-Ca含量最低，且随着NaCl-Ca含量继续增加，HCl-Ca含量明显上升。随HAc-Ca含量的增加，HCl-Ca含量波动较小，总体呈先下降后上升的趋势，HAc-Ca含量为13～15 mg/kg时，HCl-Ca含量最低。

2.3 果实品质指标间的相关性

果实品质形成是一个极其复杂的过程，各品质指标间关系密切。由表2可以看出，10个指标中共有 16对指标间|r| ＞ 0.7，表现出高度相关性[27]，且相关系数达到极显著水平 (P＜ 0.01)。其中，与果形指数 (FSI) 表现出高度相关的指标有3个，分别是黄蓝色差 (b)、果实硬度 (FF)、可溶性糖 (SSC)；与果皮亮度 (L) 表现出高度相关的指标有3个，分别是红绿色差 (a)、可溶性固形物 (TSS)、SSC；与a表现出高度相关的指标有5个，分别为L、FF、TSS、SSC、维生素C (Vc)；与b表现出高度相关的指标有3个，分别为FSI、FF、可滴定酸 (TA)；与FF表现出高度相关的指标有5个，分别为FSI、a、b、TA、SSC；与TSS表现出高度相关的指标有4个，分别为L、a、SSC、Vc；与SSC表现出高度相关的指标有5个，分别为FSI、L、a、FF、TSS；与TA表现出高度相关的指标有2个，分别为b、FF；与Vc表现出高度相关的指标有2个，分别为a、TSS。

表2 果实品质指标间的相关系数 (r)Table 2 Correlation coefficients among fruit quality indicators

2.4 施氮量对果实品质指标的影响

果实品质由外观品质和内在品质组成。由表3可以看出，随施氮量的增加，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc含量均呈现先增加后减少趋势，b和TA含量呈现先减少后增加趋势。各施氮处理的L、a、b、TSS 含量、SSC 含量与对照 (N0) 之间均存在显著差异；N50处理FSI、N400处理FF和N300处理TA，以及N300和N400处理Vc与N0无显著差异，其它各施氮处理的FSI、FF、TA和Vc均与N0之间存在显著差异。N200处理效果最为显著，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc含量分别比N0处理增加了4.46%、41.07%、67.12%、20.16%、27.02%、26.71%和38.08%，b与TA含量分别比N0处理减少了30.63%和22.49%。

表3 施氮量对果实品质指标的影响Table 3 Effects of nitrogen application on fruit quality indicators

2.5 果实总钙含量与品质指标的相关性

钙含量与果实品质之间存在显著相关。相关分析表明，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc均与果实中总钙含量呈极显著正相关 (P＜ 0.01)，相关系数分别为 0.6304、0.8021、0.9794、0.7811、0.9112、0.9522和0.7629，b、TA含量与果实中总钙含量呈负相关，相关系数分别为–0.4660和–0.4150。表明果实内总钙含量与果实品质形成密切相关。

2.6 不同形态钙对果实品质的影响

不同形态钙在果实内具有不同的功能，对果实品质指标的影响程度和方式不同。由表4可见，NaCl-Ca与H2O-Ca对果实各项品质指标的影响最大，表现为NaCl-Ca对FSI、b、FF、TA、SSC、Vc的影响位居首位，H2O-Ca对L、a和TSS的影响位居首位。不同果实品质指标受果实内不同形态钙的影响顺序不同，如：各形态钙对FSI影响程度由大到小为 NaCl-Ca ＞ H2O-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca，对FF 影响程度由大到小为 NaCl-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca＞ H2O-Ca，对TSS影响程度由大到小为H2O-Ca ＞NaCl-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca；NaCl-Ca 对 9 项品质指标均起促进作用，H2O-Ca对FSI、b、TA和果实Vc含量起抑制作用，对其余果实品质指标起促进作用，HAc-Ca对L、FF、TSS和Vc含量起促进作用，对其余品质指标起抑制作用，HCl-Ca对a、b和Vc含量起促进作用，对其余指标起抑制作用。

表4 不同形态钙对各项果实品质指标的影响程度及方式Table 4 Influence degree and manner of different forms of calcium on each fruit quality index

3 讨论

3.1 施氮量对果实不同形态钙的影响

果实中的钙以5种不同的形态存在，分别为水溶性钙、果胶酸钙、磷酸钙，草酸钙和残渣钙[11]。果实中各种形态的钙都有其不同的生理功能，在一定的生理环境条件下相互转化[12-14]。本试验研究发现，施氮处理显著提高了果实总钙含量，施氮量在200 kg/hm2时，效果最为显著，比对照增加了73.47%。此外，施氮量在200 kg/hm2时，果实中水溶性钙、果胶酸钙、磷酸钙的含量均显著增加。本试验还发现，随施氮量的增加，果实中不同形态钙的比例发生了变化，水溶性钙和果胶酸钙含量变化最大。施氮量为200 kg/hm2时，水溶性钙和果胶酸钙占据总钙含量的比例分别比N0增加了6.95%和3.15%。

分析富士苹果果实中不同形态钙的相关性，发现水溶性钙与果胶酸钙含量与总钙含量呈极显著正相关，说明氮处理增加总钙含量，主要是增加了水溶性钙和果胶酸钙含量，这与王雷[28]、马建军等[11]、Silveira等[29]研究结果一致，说明水溶性钙与果胶酸钙的含量变化是影响果实中钙积累的重要因子。水溶性钙和果胶酸钙为活性钙，二者与草酸钙呈正相关。说明随总钙含量的增加，二者占总钙含量比例增高，活性钙与草酸结合形成草酸钙增多，从而避免液泡内钙离子过多而影响液泡中阴阳离子平衡[30]。草酸钙和大部分磷酸钙沉淀在液泡内[14]，二者均由游离钙离子结合而成，推测两者存在竞争作用，因此呈负相关。并且根据果实内不同形态钙的分布 (图2)可以发现，在不同施氮量下，果实中不同形态钙的变化趋势不一致，且伴随着一种形态钙含量的增加，其余形态的钙均不呈线性增加或降低，推测在不同施氮量下，富士苹果果实内不同形态钙之间发生了相互转变。

3.2 施氮量对果实品质的影响

氮肥在苹果果实品质的形成过程中有着极为重要的作用。适量施氮可改善果形和色泽[31]，但对于适宜施氮量研究结果[32-33]不同，可能与树龄、品种以及地域差异有关。本试验研究表明，施氮量在200 kg/hm2时，富士苹果的果形指数、果皮亮度和红绿色差显著高于其他处理，说明200 kg/hm2的施氮量显著改善了果实外观，表现为果形指数变大，果皮亮度明显提高，果实偏红。施氮量过高或者过低，都不利于果实外观品质形成。关于氮肥施用量对果实内在品质影响的研究已有很多，适量施氮可显著提高可溶性固形物、维生素C及可溶性糖含量[32-34]，施氮量为300 kg/hm2时，库尔勒香梨果实中的可滴定酸含量可降低0.1 g/kg[35]。本试验结果显示，施氮量在200 kg/hm2时，可溶性固形物、可溶性糖和维生素C含量分别比N0增加了27%、27%、38%，可滴定酸含量降低了22%，施氮量过高或者过低，果实内可溶性固形物、可溶性糖和维生素C含量均降低，可滴定酸含量升高，说明200 kg/hm2的施氮量有利于富士苹果内在果实品质的形成。

果实品质指标间存在显著相关性。可溶性糖、可溶性固形物含量与可滴定酸呈显著负相关，可能是因为果实发育过程中，一部分酸转化为糖，另一部分作为呼吸底物被消耗了[36]。糖分积累是着色的基础[37]。研究表明，果实着色度与可溶性固形物、可溶性糖含量呈显著正相关，与果实硬度呈显著负相关，因此李猛等[38]将果实着色度作为分级贮藏的重要依据。在维生素C主要合成途径L-半乳糖合成途径中，可溶性糖是主要底物，较高的可溶性糖可促进维生素C合成，可能是糖和维生素呈正相关的原因[39]。果实各项品质指标间存在高度相关性。虽然这些相关性存在差异，但正是这些不同指标之间的相互制约关系，形成了富士苹果独特的品质和特色[40]。

3.3 不同形态钙与果实品质指标的关系

钙对果实品质的形成起重要作用。研究表明，果实内适宜的钙含量有利于果实硬度的增加，可溶性固形物和可溶性糖含量提高[41]，这与本研究结果一致。果实内钙含量与果形指数、果实硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量等果实品质指标之间表现出高度相关性，且相关系数达到极显著水平 (P＜0.01)，说明果实内钙含量可显著影响果形指数、果实硬度、可溶性固形物含量等果实品质指标。不同形态钙在果实中有着不同的功能[12]，水溶性钙和果胶酸钙是果实中的活性钙，能维持细胞壁的稳定，提高果实硬度[42]；磷酸钙的形成与ATP的能量代谢相联系，当果实中磷酸钙过多时，磷酸基的能量代谢受阻[43]；草酸钙的形成可阻止果实中由于草酸过多破坏中胶层而诱发的苦痘病[44]。但不同形态钙对果实各项品质指标的影响程度及影响方式不明确，在此基础上，本研究评估单一形态钙以及多种类型钙对果实品质各项指标的影响发现，对于某一项果实品质指标而言，对其影响较大的钙形态多为1种或1种以上，并且4种形态钙的影响程度和影响方式不同[26]。其中果胶酸钙与水溶性钙为影响果实品质指标的两种主要形态[25]，对各项果实品质指标的影响最大。本研究还发现，果胶酸钙对各项果实品质指标均起促进作用，说明果实中果胶酸钙含量增加有利于提高果实品质。水溶性钙、磷酸钙和草酸钙对果实某些品质指标有促进作用，对某些品质指标有抑制作用，且其中一种形态钙对某项品质指标不能同时起促进或者抑制作用[26]。因此，为获得高品质的果实，需要对不同施氮量下果实内不同形态钙与果实品质指标的关系进行更加深入地研究，以达到通过调节施氮量，调控不同形态钙的含量和组成比例，进而提升果实品质的最终目的。

4 结论

1) SH38中间砧富士适宜施氮(N)量 为200 kg/hm2，此时果实品质最好，果实果形指数较大，果皮亮度和红绿色差最高，可溶性固形物、可溶性糖、维生素C含量最高，可滴定酸含量最低。

2) 施氮可增加果实中总钙含量，改变各形态钙的组成比例。施氮(N)量为200 kg/hm2时，果实中总钙含量最高，对品质影响最大的钙形态为果胶酸钙和水溶性钙，果胶酸钙对各项品质指标均起促进作用。