不同时间电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠心功能、胰岛素抵抗的影响及机制研究*

马劼旎,吴 松,李 丹，李方文卉，韩永丽,陈 松，赵 敏

(湖北中医药大学,湖北 武汉 430061)

心肌缺血(Myocardial ischemia，MI)是因冠状动脉持续性缺血缺氧引起，可导致心肌梗死或心力衰竭等损伤，该病发病率和病死率呈上升趋势。重建冠状动脉血流是该病常规的临床治疗手段，但恢复心肌供血及供氧的同时，心肌组织损伤会加重，称为缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI),在治疗心肌缺血中减轻缺血再灌注损伤成为关键因素。针灸预处理作为针灸治未病的手段之一，具有良好的预治作用，临床研究表明，针刺预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤，对其治疗具有一定效果，但其机制尚未完全明确[1-2]。在各种急性心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia - reperfusion injury，MIRI)大鼠模型中，以在体冠状动脉结扎最为常用，左心功能指标能较好反映MIRI对心脏机能所造成的影响和心室重构的情况[3-4]。亦有研究表明胰岛素抵抗是多种代谢疾病的共同病理表现，其参与了MIRI对心肌损伤的全过程[5]。本实验通过观察左心室心功能指标、大鼠血浆内β-内啡肽、胰岛素、C肽和抵抗素的含量及心肌细胞结构，对电针预处理“内关”对MIRI的保护作用及时间规律进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要实验仪器 ST-360型酶标仪(上海科华实验系统有限公司);ALC-V8S小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司);BL-420系统(成都泰盟科技有限公司);HANS-200型电针治疗仪(南京济生医疗科技有限公司);TGL-10B系列台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.1.2 主要试剂 β-内啡肽、胰岛素、C肽和抵抗素试剂盒购自北京莱博特利生物医学科技有限公司。

1.2 实验动物及分组

1.2.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠60只,体质量180～220 g，购于湖北省医学科学研究院实验动物中心[动物使用许可证号：SYXK(鄂)2012-0067]。购入后适应性喂养7 d，饲养于湖北中医药大学SPF级标准动物房，饲养条件：动物房温度为20～25℃，相对湿度(50±10)%，自由进食进水。动物实验在湖北中医药大学科研中心进行。

1.2.2 实验分组及处理方法 大鼠适应性喂养1周开始实验，采用随机数字表法，将60只大鼠随机分为6组：对照组(S组)、模型组(M 组)、电针预处理0.5 h组(EA1组)、电针预处理1 h组(EA2组)、电针预处理2 h组(EA3组)和电针预处理3 h组(EA4组)。对照组：常规饲养，开胸后暴露心脏不做其他处理；模型组：采用左前降支冠状动脉结扎术，开胸后缺血20 min，再灌注40 min;各电针刺预处理组：分别于造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h选取大鼠双侧“内关”穴进行电针，造模方法同模型组。

1.3 心肌缺血再灌注模型的建立

1.3.1 心肌缺血模型制备 将大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠溶液麻醉，把大鼠固定于鼠台，将其四肢连接电极，心电导连线按右前肢(绿) 、右后肢(黑)和左前肢(红)相连，进行心电监测[6-7]。剪开其颈部皮肤并暴露气管，在气管切口插入导管，使用呼吸机辅助呼吸。心前区剪毛并消毒，在左胸骨第3、4肋间暴露心脏，结扎前降支冠状动脉，打活结造成缺血模型，并在缺血20 min后，行左冠状动脉缺血再灌注术。

1.3.2 制备成功标志 心电监测中ST段明显抬高为缺血标志；再灌注时心电图抬高的ST段下降，且局部有反应性充血的现象，即为造模成功[8]。

1.4 电针预处理方法

除对照组与模型组外，EA1组、EA2组、EA3组和EA4组针刺预处理时间分别为：造模前0.5 h、1 h、2 h和3 h。方法为上述4组大鼠置于鼠台，参照华兴邦等制定的《大鼠穴位图谱的研制》[9]取穴，在前肢内侧离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间取双侧内关，用0.30 mm×15 mm毫针针刺双侧穴位，针刺深度约5 mm，接HANS-200电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，强度为1 mA，电针30 min。

1.5 指标检测

1.5.1 左心室心功能指标的测定 接入呼吸机，分离大鼠颈总动脉，对其颈外静脉和颈动脉进行插管，连接BL-420系统，待造模成功后，收集各组舒张末期压力(end-diastolic pressure,LVEDP)、左室收缩期平均压(left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.5.2 血浆β-内啡肽、胰岛素、C肽和抵抗素的测定 MIRI造模成功后，用10%水合氯醛进行麻醉，取2 mL腹主动脉血，置于肝素抗凝管中，常温下在离心机3 000 r/min离心15 min取得血清，随后将血清进行分离，并按照试剂盒说明书上进行操作。

1.5.3 心肌组织形态学观察 将大鼠心肌组织置于缓冲液中进行漂洗，使其固定3 h，随后按照脱水、包埋、固化和切片的步骤，切片厚度为50～100 nm,使用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在透射电镜下观察心肌细胞结构。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 各组大鼠舒张末期压力、左室收缩期平均压、左心室内压最大上升速率和左心室内压最大下降速率比较

与S组相比较，M组、EA1组、EA2组、EA3组和EA4组的LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax下降，差异有统计学意义(P<0.05)。EA1组、EA2组、EA3组和EA4组与M组比较，LVEDP显著降低，LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平有所上升(P<0.05)。尤其是EA3组、EA4组对于LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的影响明显优于EA1组和EA2组(P<0.05)，EA1组和EA2组比较，各项指标差异无统计学意义(P>0.05)，EA3组和EA4组比较，各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠 LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比较

2.2 各组大鼠β-内啡肽、胰岛素、C肽和抵抗素比较

与S组相比较，M组、EA1组、EA2组、EA3组和EA4组的β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素的含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。EA1组、EA2 组、EA3组和EA4组与M组比较，能显著下调β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素的表达(P<0.05)。尤其是EA3组、EA4组对于β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素含量的影响明显优于EA1组和EA2组(P<0.05)。EA1组和EA2组对于β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素含量的影响差异无统计学意义(P>0.05)，EA3组和EA4组比较β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素比较

2.3 大鼠心肌细胞形态学观察(电镜)

见图1。S组大鼠心肌肌纤维组织排列较为规整，心肌细胞胞质充实，线粒体数量为正常值，未见明显异常；M组大鼠心肌细胞结构较为模糊，心肌肌纤维溶解，线粒体肿大，其肌浆网可见明显扩张和肿胀；EA1组、EA2组、EA3组和EA4组的心肌肌纤维排列较为整齐，线粒体有部分肿大，心肌细胞肿胀减少，其中EA3组和EA4组的心肌纤维排列更为齐整，线粒体结构完整，自噬空泡较少，溶酶体较多。

3 讨论

心肌缺血后会出现左心室重构，并逐步发展为心力衰竭的慢性阶段，同时伴有心功能下降和心室扩张[10]。左室舒张末期压力(end-diastolic pressure,LVEDP)增大表明舒张末期耗能增加，左室收缩期平均压(Left ventricular systolic mean presure,LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)则反映心肌的收缩能力，四者相结合能较好地反映心室重构的情况[4]。有研究表明，导致心肌缺血患者心功能损伤的因素众多，其中由MIRI引起的心肌胰岛素抵抗可能是导致心功能损伤及患者并发症发生率和病死率增加的重要原因之一，因此降低甚至纠正心肌胰岛素抵抗可能对改善患者预后具有重要意义[11]。血清C肽水平可反映胰岛细胞贮备功能，其作为有效评估胰岛功能的方法，在一定程度上可反映胰岛素抵抗的情况[12]。β-内啡肽(β-endorphin，β-EP)属于内源性阿片肽系统，该物质在脑神经系统中大量存在，在急性冠脉综合征发生、发展的过程中起重要作用，能够通过调节自主神经系统来参与心血管活动，有研究发现中枢与外周β-内啡肽对在体大鼠MIRI有保护作用[13]。也有研究发现，在休息时β-内啡肽可影响胰岛素和胰高血糖素水平，从而可能影响运动过程中葡萄糖的作用，并且血清C肽在运动过程中水平下降[14]。因此本实验通过对β-内啡肽、胰岛素、C肽和抵抗素含量的测定，来探究胰岛素抵抗机制作用及影响。

心肌缺血属于传统医学中“胸痹心痛”的范畴，临床以胸痛、胸闷、短气、疲乏无力与心律失常等为主要表现。本实验根据中医“治未病”的理论，采用电针“内关”预处理的方法防治心肌缺血。针刺预处理蕴含着针灸“治未病”的思想理论，针灸用于预防疾病称为“逆针灸”，是我国传统中医药治未病的主要手段之一。《素问·刺热论》中记载：“病虽未发，见赤色者刺之，名曰治未病。”治未病是指在疾病未发生之前进行防治，其理念与现代预防医学有共通之处，即预防疾病的发生优先度高于发病后治疗，从而降低疾病的发病率，提高国民的健康水平。“内关”穴为手厥阴心包经之络穴，通于阴维脉，对于心胸部疾病有良好疗效。《针灸大成·治病要穴》曰：“内关：主气块，及胁痛，劳热，疟疾，心胸痛。”且《针灸大成·八法交会八穴歌》中记载：“公孙冲脉胃心胸，内关阴维下总同”，也提到内关为治疗心系疾病的重要穴位之一。

本实验结果表明,与模型组比较，电针“内关”预处理可通过降低LVEDP，升高LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax水平，改善左心功能和影响心室重构；同时电针干预能显著下调β-EP、胰岛素、C肽和抵抗素的含量，有效调控胰岛素抵抗相关因子，减少心肌组织的损伤。透射电镜结果提示，模型组大鼠心肌细胞结构较为模糊，心肌肌纤维溶解，线粒体肿大，其肌浆网可见明显扩张和肿胀；电针预处理组的心肌肌纤维排列较为整齐，线粒体有部分肿大，心肌细胞肿胀减少，其中EA3组和EA4组的心肌纤维排列更为齐整，线粒体结构完整，自噬空泡较少，溶酶体较多，说明电针预处理可以减轻心肌组织的损伤，保持其结构和功能的完整性。其中，电针预处理2 h组和电针预处理3 h组对各项指标的改善情况优于电针预处理0.5 h组和电针预处理1 h组，该结论提示不同时间点对心肌组织的保护效应具有一定差异。有研究表明针刺预处理内关穴3～5 d均能有效降低心肌梗死面积，其中以4 d为佳，但预处理超过3 d后电针的保护作用进入平台期[14]。本实验电针预处理时间点的选择为造模前0.5～3 h,可较好发挥针刺即时效应，避免平台期对保护效应的影响，但由于样本量较小，针刺预处理时间点的选择仍需进一步探究。本实验结果证实了电针“内关”预处理能通过调控应激反应及胰岛素抵抗相关因子来保护受损心肌组织，降低 MIRI 对心功能的损害，且预处理的时间点选择对心肌的保护作用有差异性。本研究笔者从胰岛素抵抗的角度讨论了电针预处理对心肌缺血保护作用的可能机制，但由于样本量和其他条件的限制仍需进行深入研究，为临床心肌缺血的治疗提供思路。