圆头精子症患者精子形态观察及全外显子测序分析

王红梅，李文悌，庄春波，张世杰，李兴武

郑州大学第一附属医院检验科 郑州 450052

男性原因引起的不孕不育占整个不孕不育的近50%。圆头精子症(globozoospermia)是一种严重且罕见的精子畸形[1-2]，在男性不育症中占比不足0.1%，主要表现为精子头部呈正圆形，顶体缺陷或缺失，伴随尾部异常[3-4]，由于其顶体酶减少或缺失从而使得精子不能顺利穿过卵子透明带，不能与卵子结合而引起不育。圆头精子症产生的确切原因与机制还不十分明确，有报道[5-7]其与多种基因异常有关，如精子发生相关基因16 (spermato-genesis associated 16，SPATA16)、编码跨膜结构域蛋白的基因DPY19L2等。本研究对1例圆头精子症患者的精液进行常规分析和形态学观察，并利用全外显子测序技术探讨其基因变异情况。

1 对象与方法

1.1研究对象男性，34岁，婚后8 a(未采取避孕措施5 a)未育，体格健壮。泌尿外科常规体检：第二性征明显,无过敏史,无心、肺、肝等实质脏器疾患,无吸烟、酗酒等不良习惯；B超示睾丸、输精管、附睾、精索静脉均正常；传染病四项均阴性，促卵泡生成素(FSH)、泌乳素(PRL)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、黄体酮(PROG)、睾酮(TESTO)均正常，遗传核型为46,XY，精浆生化检测(酸性磷酸酶、中性α-糖苷酶、果糖、乳酸脱氢酶X)均正常，精子顶体酶活性降低，为45.7 μIU/106个精子(参考值≥64.9 μIU/106个精子)。禁欲5 d后手淫取精液于专用无菌大试管中，立即送实验室进行精子质量分析和形态学分析。同时选取健康有生育能力的志愿者的精液一并做形态学分析。本研究已通过郑州大学第一附属医院科研和临床试验伦理委员会审查，伦理审查编号：2019-KY-131。

1.2精液常规分析及精子形态学分析按第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》，分别取患者和志愿者精液2 μL滴于进口专用计数池，置于西班牙SCA精子质量分析系统进行精子质量分析。分别将患者精液及志愿者精液2 μL滴于GoldCyto Spermblue精子形态染色分析玻片上，用加样枪尖顺时针、逆时针适当搅动，使标本与染液充分混合，加一次性盖片，56 ℃加热5 min，置OlympusCX31显微镜(×100)下观察并计数异常形态精子数，计算精子头部畸形率及圆头精子率。

1.3全外显子测序取患者静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝，送上海明码生物科技有限责任公司进行基因全外显子测序。测序流程如下：提取外周全血基因组DNA，依次进行末端补平、3’端腺苷化、接头连接、片段选择及扩增，完成 DNA 文库构建。然后使用安捷伦全外显子组目标区域捕获探针进行杂交，使用磁珠捕获杂交的目的片段并分离纯化。PCR扩增捕获的DNA 片段并纯化PCR产物，然后进行捕获文库质检。调整待测DNA文库浓度，按照Illumina的标准流程进行高通量测序。最后对测序数据进行分析，使用ClinVar、OMIM 和HGMD数据库筛选可疑的致病变异。

1.4实时荧光定量PCR检测DPY19L2基因拷贝数变异分别取患者及健康对照者静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝。采用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取患者血液基因组DNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ reagent (TaKaRa公司) 试剂盒检测DPY19L2基因拷贝数相对水平。利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，DPY19L2上游引物5’-TAGCCAAGGGAAGCCGTGAT-3’，下游引物5’-AGCCATGTGCGGGATGTAAT-3’, 由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反应体系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL、10 μL TB Green、2 μL DNA模板、0.4 μL ROX以及6 μL无核酸酶水。PCR反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。以健康男性基因组DNA为对照，采用2-ΔCt(ΔCt=Ct患者-Ct对照)法计算患者DPY19L2基因拷贝数相对水平。患者和健康对照样本各做3个复孔。

1.5Sanger测序检测单核苷酸变异取患者静脉血3 mL,抗凝，提取基因组DNA。根据DNAH1基因NM_015512.4:c.871+3G>A和ZMYND10基因NM_015896.2:c.833G>C 变异位点设计特异性引物。DNAH1上游引物5’-GCTTTCTTCCAGGTATTT GACAA-3’，下游引物5’-TGTCTACCAGCTGAGAG GTCTTG-3’；ZMYND10上游引物5’-AAAAGAG CACTGGGGTTGAG-3’，下游引物5’-GCTGGCT CACTTGAAGAGAATT-3’。使用 PCR 扩增试剂盒(TaKaRa公司)对靶序列进行扩增，反应体系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL，10 μL TB green，2 μL DNA模板，0.4 μL ROX以及6 μL无核酸酶水。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增40个循环。PCR产物送上海生工生物科技有限公司进行Sanger测序，测序结果与GenBank数据库中的参考序列进行比对。

2 结果

2.1精液常规分析及精子形态分析结果精液pH 7.5，精子活动率56.0%，前向运动(PR)：22.4%，非前向运动(NP)：33.6%，无运动(IM)：44.0%。精子密度32.7×106个/mL。 精子形态分析结果：精子头部畸形率100%，均为圆头精子，缺乏顶体(图1)。

图1 患者(左)和健康对照(右)的精子形态

2.2全外显子测序结果分析及验证该患者DPY19L2基因区域测序深度降低，提示DPY19L2基因纯合缺失，并携带DNAH1(c.871+3G>A)和ZMYND10 (c.833G>C，p.Arg278Pro)基因杂合突变。与健康对照相比，该患者DPY19L2基因拷贝数相对水平明显降低，仅为正常水平的30%[(0.293±0.109)vs(1.001±0.025)]，提示存在DPY19L2基因纯合缺失。此外，对单核苷酸变异的验证结果显示，该患者确携带DNAH1基因c.871+3G>A杂合突变和ZMYND10 基因c.833G>C杂合突变(图2)。

A：患者DNAH1基因存在c.871+3G>A杂合突变；B：DNAH1正常基因型；C：患者ZMYND10基因存在c.833G>C杂合突变；D：ZMYND10正常基因型

3 讨论

虽然圆头精子症在不育男性中的发病率低于0.1%，但临床上并不十分罕见，根据严重程度可分为两种类型：Ⅰ型，精子头部完全不存在顶体和顶体酶；Ⅱ型，精子保留残余顶体或存在其他形态类异常。安娜等[8]曾在透射电镜下观察圆头精子的超微结构，显示精子质膜破损，顶体缺失，细胞核内含有空泡，线粒体空泡化且排列杂乱，堆叠在一起，微管的9+2结构不明显，精子颈部或尾部卷曲。用超高倍精子放大系统或传统光学显微镜虽然无法观察精子内部的超微结构，却能较清晰地观察精子的外部形态，染色后能清晰地观察到精子顶体、胞核，以及空泡等，圆头精子却看不到顶体。由于顶体内含有精子与卵母细胞受精所需要的酶类，因此在女性体内缺乏顶体的异常精子不能顺利穿过卵子的透明带，就无法使卵母细胞受精，患者表现为不育[9]。

关于圆头精子症导致男性不育的确切机制目前尚不明确，文献[10]报道显示超过 80%的圆头精子症的发生是由于DPY19L2基因缺失导致。Alvarez等[11]的研究显示，DPY19基因家族包括4个基因：DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3和DPY19L4。DPY19L2基因的突变导致功能性DPY19L2蛋白的丧失，可导致精子生成障碍9型[MIM：613958]，从而导致精子头部延长和顶体发育障碍。但是，圆头精子症患者除不育之外，并未发现其他特殊症状和体征，染色体和Y染色体微缺失均未见异常。本研究未检测到明确的导致圆头精子症的致病基因或变异，也未发现与其表型相关的点变异及小片段插入缺失变异，却发现DPY19L2基因部分区域测序深度降低，提示DPY19L2基因纯合缺失。该大片段缺失变异曾在多例圆头精子症患者中被检测发现。Koscinski等[10]对4例圆头精子症患者的检测发现DPY19L2基因有约200 kb的纯合缺失。另有研究[12]发现，54名圆头精子症患者中多名患者受累于该基因的纯合缺失。该患者精液常规分析均在正常值范围内。

该研究结果同时显示全外显子测序检测到DNAH1基因、ZMYND10基因存在变异，其基因变异信息分别为NM_015512.4:c.871+3G>A和NM_015896.2:c.833G>C(p.Arg278Pro)，均属于杂合子突变，分别可能引起精子生成障碍18型[13][MIM:617576]和原发性纤毛运动障碍22型[14][MIM:615444]，表现为精子鞭毛的多种形态学缺陷和男性不育，然而这两个基因变异目前尚不能判定与圆头精子症有关，有待进一步研究。

总之，圆头精子症基因缺陷表现多样，DPY19L2基因纯合缺失可能是本例圆头精子症的发病原因。