应用种特异性ITS引物（SS-ITS）鉴别新菠萝灰粉蚧

徐淼锋 闫邦奇 管维 廖力 蔡波 李惠萍

摘要 [目的]研究新菠蘿灰粉蚧的种特异性ITS引物，以快速准确鉴定该虫，可为口岸快速通关提供依据。[方法]采用PCR扩增方法，首次测定分析了11 种粉蚧39 个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列。基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物，通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法。[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带，能有效扩增出约665 bp的DNA片段，其余种类均未有扩增条带。灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高，其检测限可达0.1 ng/μL。[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定，该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考。

关键词 新菠萝灰粉蚧; 分子鉴定; 核糖体DNA

中图分类号 S41;Q96 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）03-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.037

Abstract [Objective]The speciesspecific ITS primer for D.neobrevipes was studied to rapidly and accurately identify the pests，which can provide the basis for the port customs clearance.[Method]The complete fragments of rDNA ITS were sequenced by universal primer PCR amplification method for 39 samples of eleven species including D.neobrevipes and other mealybugs.Speciesspecific primer of D.neobrevipes was designed based on sequences variation of rDNA ITS among the eleven mealybugs.A rapid molecular identification method for D.neobrevipes was established by screening primer annealing temperature and optimizing PCR reaction conditions.[Result] The ITS speciesspecific primers only amplified the band of D.neobrevipes，and could effectively amplify DNA fragments of about 665 bp.And the other species did not have amplified bands.The sensitivity test results showed that the primer had high sensitivity and the detection reached to 0.1 ng/μL.[Conclusion]The rapid molecular identification for D.neobrevipes using the ITS speciesspecific primers designed in this paper is feasible.This method provides reference for the detection and identification of the port.

Key words Dysmicoccus neobrevipes;Molecular identification;Ribosome rDNA

新菠萝灰粉蚧（Dysmicoccus neobrevipes Beardsley）隶属半翅目（Hemiptera）粉蚧科（Pseudococcidae）灰粉蚧属（Dysmicoccus），为我国禁止进境植物检疫性有害生物，严重危害多种水果和观赏植物，是具有重要经济意义的害虫[1-3]。该虫与近似种菠萝灰粉蚧（D.brevipes）在形态特征、寄主植物及分布区域等方面都极为相似。近年来，我国从菲律宾、越南、泰国、印度尼西亚、韩国、柬埔寨、马来西亚和我国台湾等地进口的菠萝、菠萝蜜、香蕉、龙眼、榴莲、番荔枝和山竹等寄主上截获过以上2种粉蚧[4]，据统计在2005—2017年，共截获3 111 批次新菠萝灰粉蚧和2 392 批次菠萝灰粉蚧。目前，新菠萝灰粉蚧在我国海南和广东有危害报道，且呈急剧蔓延扩散趋势[2]。傅辽等[5]根据CLIMEX 3.0与ArcGIS 9.3结合的方法分析了新菠萝灰粉蚧在我国目前以及未来的潜在地理分布，发现该虫在我国包括海南、广东、广西、云南、福建、台湾等地高度适生。由于粉蚧虫体小、体覆盖白色蜡粉、身体为膜状结构等特点，其鉴定十分依赖雌成虫玻片制作的好坏及微观特征识别，这些往往需要经验丰富的专业人员才能做到。因此研究该虫的准确、快速鉴定可有效防止新菠萝灰粉蚧新的传入和扩散。

据报道，同一物种的核糖体DNA（rDNA）序列高度保守，无明显的变异，而种间的rDNA序列具有高度变异性，因此，rDNA常作为昆虫等生物的分子标记基因用于种类的快速鉴定[6-7]。rDNA由编码区和非编码区组成，非编码区序列种间差异较大，因此，常在18S、5.8S和28S编码区之间的核糖体内转录间隔区的ITS1和ITS2区域设计特异性引物用于种类的快速鉴定。据记载，ITS 区序列被广泛应用于双翅目、膜翅目昆虫种下分类和近缘种鉴别[8-9]; Park等[10]通过分析粉蚧ITS区，设计特异性引物用于区分危害韩国产雪梨上的6 种粉蚧。Beuning等[11]基于分析ITS区差异序列，设计常规PCR引物，可特异区分新西兰常见的4 种粉蚧。笔者尝试基于rDNA ITS序列特征差异设计种特异性引物建立针对新菠萝灰粉蚧的分子快速检测方法，为该虫的快速鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源 所用材料为2014—2017年珠海口岸及海口口岸进境水果上截获的粉蚧样本，共11 种36 个样品。所有标本用无水乙醇浸泡并保存于-20 ℃冰箱中供试验用。试验样本基本信息见表1。

1.2 DNA提取

粉蚧类昆虫DNA提取参照廖力等[12]的方法并稍加改进。将单头供试新鲜虫样置于200 μL離心管中（如经乙醇浸泡，需要用0.9% NaCl溶液洗涤3 h以上），加入60 μL提取液A （含1% SDS，50 mmol/L TrisHCl，25 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA），用研磨棒捣碎样品，振荡混匀后于65 ℃孵育45 min （中途混匀2次）;孵化结束后，加入等体积提取液B [3 mol/L KAC（pH 7.2）]，缓慢上下颠倒混匀后于冰上放置1 h;取出后，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液移入新的500 μL离心管中，加入2倍体积冷冻无水乙醇，轻轻混匀后置于-20 ℃冰箱1 h;取出后，于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，小心弃去上清液，加入500 μL 75%乙醇洗涤沉淀，于4 ℃、12 000 r/min离心10 min，小心弃去上清液。然后将离心管倒扣于洁净的滤纸上，自然晾干20 min后，每管加入50 μL dd H2O充分溶解，DNA溶液用Nano Drop 1000微量分光光度计测定核酸质量和浓度，于-20 ℃保存备用。

1.3 粉蚧类昆虫ITS序列PCR扩增及序列测定

粉蚧类昆虫的ITS全序列PCR扩增通用引物（ITSF/ITSR）参照徐淼锋等[7]，分别为上游引物ITS F的碱基序列为5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，下游引物ITS R的碱基序列为5′-TATGCTTAAATTCGGCGGGTGA-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。然后，以新菠萝灰粉蚧、菠萝灰粉蚧等11种我国口岸常截获的粉蚧类害虫成虫DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为30 μL，每体系分别加入15 μL 2×PCR缓冲液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2 μL （10 μmol/mL）、Taq DNA聚合酶0.6 μL （1.25 U/μL），最后加ddH2O补充至总体积为28 μL，再加2 μL DNA模板，体系配好后进行PCR扩增。PCR反应条件为94 ℃预变性1 min; 35个循环为98 ℃ 变性10 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s;最后72 ℃延伸5 min，结束后产物于4 ℃冰箱保存。反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）。

电泳及测序：取5 μL PCR产物，加1 μL 6×上样缓冲液（Loading Buffer），在 1%琼脂糖凝胶上以90 V电泳 （电泳液为1×TAE） 分离45 min，以BioRad GelDoc XR凝胶成像系统分析电泳结果。对经电泳检测合格的PCR产物进行双向测序，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司和天一辉远基因科技有限公司协助完成。

1.4 新菠萝灰粉蚧特异性SS-ITS引物的设计及退火温度筛选

根据新菠萝灰粉蚧及其他10 个种类共36 个样本的ITS测序结果，通过MEGA6.0[13]比对分析序列差异性，采用Primer primer 6软件设计新菠萝灰粉蚧SS-ITS引物1对（ITS Dn260F/ ITS Dn925R），上游引物ITS Dn260F的碱基序列为5′-CAAGTCGCCGTATCGAGTAC-3′，下游引物ITS Dn925R的碱基序列为5′- CGGCGAGGTATCTACTGCT -3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。用新菠萝灰粉蚧（5025786）基因组DNA为模板，对新菠萝灰粉蚧种特异性SS-ITS引物进行梯度PCR反应来摸索该对引物的最佳退火温度，退火温度范围上限为平均Tm值高5 ℃、下限为平均Tm值低5 ℃（ITSDn260F/ITSDn925R其平均Tm值約为58 ℃，则退火温度范围设定为53～63 ℃，筛选出该对引物的最佳退火温度为60 ℃。

1.5 引物的种特异性及灵敏度检验

分别以我国口岸进境水果上常见的11 种粉蚧成虫的DNA为模板，以新菠萝灰粉蚧为阳性对照，检验新菠萝灰粉蚧SS-ITS引物ITS Dn260F/ ITS Dn925R的种特异性。PCR反应体系为30 μL，每体系分别加入15 μL 2×PCR缓冲液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2 μL （10 μmol/mL）、Taq DNA聚合酶0.6 μL（1.25 U/μL），最后加ddH2O补充至总体积为28 μL，再加2 μL DNA模板，体系配好后进行PCR扩增。反应条件：94 ℃预变性1 min;35个循环为98 ℃变性10 s; 60 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸5 min;最后于4 ℃保存。扩增产物的检测方法与“1.3”相同。以新菠萝灰粉蚧成虫DNA为模板，稀释6 个10 倍浓度梯度来进行灵敏度检验，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 粉蚧类昆虫ITS序列PCR扩增 以新菠萝灰粉蚧、菠萝灰粉蚧、暗色粉蚧、李比利氏灰粉蚧、南洋臀纹粉蚧、桔臀纹粉蚧、大洋臀纹粉蚧、榕树粉蚧、柑栖粉蚧、日本臀纹粉蚧和杰克贝尔氏粉蚧等口岸常截获的11 种粉蚧共36 个样本的基因组DNA为模板，以通用型引物ITSF/ITSR进行PCR扩增。电泳检测结果显示，引物ITSF/ITSR对粉蚧的ITS序列扩增通用性较好，11 种粉蚧均能扩增出一条清晰的目标片段，长度约在1 200 bp（图1）。将经电泳检测合格的产物进行双向测序，结果显示，以上11 种粉蚧的ITS区PCR产物长度在1 222～1 495 bp。

2.2 新菠萝灰粉蚧SS-ITS引物的种特异性检验

以新菠萝灰粉蚧及其他10 种粉蚧成虫的DNA为模板，以设计的种特异性SS-ITS引物（ITS Dn260F/ ITS Dn925R）进行PCR扩增，用所建立的PCR检测体系，对新菠萝灰粉蚧及其他种类进行种特异性引物检验。为确保结果的可靠性，每次试验均重复3次。电泳结果显示，该对引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增效果，能扩增出约665 bp的DNA片段（图2），其余10 个种类均未扩增出条带，表明该对引物为新菠萝灰粉蚧的种特异性引物。

2.3 引物的灵敏度验证

利用微量分光光度计（Nanodrop 1000）测定新菠萝灰粉蚧（5025786）的DNA浓度为102.3 ng/μL。用所建立的PCR检测体系，以新菠萝灰粉蚧DNA模板稀释5 个10 倍浓度梯度的DNA模板来确定PCR反应的检测灵敏度，试验重复3次。结果显示，模板浓度在1～100 ng/μL时，均能扩增出强烈的检测信号;对于0.1 ng/μL的DNA模板，检测扩增产物明显降低，检测信号较弱;当DNA模板浓度为0.01 ng/μL时，由于无扩增产物或检测信号太弱而无法检出。表明该方法具有较高的灵敏度，其检测限度为0.1 ng/μL，最适检测浓度为1～100 ng/μL（图3）。

3 讨论

粉蚧的识别一直以来是一线口岸鉴定的难点。其鉴别主要依据雌成虫的形态特征，而现场检疫通常截获的是卵和若虫而无法通过形态特征鉴定，即使截获的是雌成虫也需要制成玻片标本，其流程是一个繁琐、耗时的过程。这与进口水果的快速检疫、快速通关的要求不符。研究表明，通过DNA条形码技术和分子标记技术可鉴别新菠萝灰粉蚧。如徐浪等[14-15]采用DNA条形码技术和线粒体COI基因片段差异特征对进口水果上截获的新菠萝灰粉蚧及其近似种进行了鉴别。黄蓬英等[16]应用28S rDNA基因区段的差异，设计了一种特异性引物用于鉴别新菠萝灰粉蚧。该研究首次分析了珠海口岸和海口口岸进境水果上常截获的11 种粉蚧36 个样本的ITS区序列，通过分析新菠萝灰粉蚧及其他种类ITS区的序列差异，设计了新菠萝灰粉蚧的种特异性引物，扩增得到的特异性片段长度约为665 bp。该试验结果表明，该对引物可成功区分新菠萝灰粉蚧及其他常见种类，灵敏度可高达0.1 ng/μL。

综上所述，该研究建立的SS-ITS特异性引物快速鉴定新菠萝灰粉蚧的方法具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，最快可在24 h内完成新菠萝灰粉蚧的鉴定，能够满足口岸进境水果快速检疫、快速通关的要求;对防止该虫的进一步蔓延扩散具有重要意义。

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