lncRNA LINC01410在子痫前期临床意义与对滋养细胞增殖侵袭影响

杨 扬，兰瑞红，龚护民

(海南医学院附属海南总医院/海南医学院附属海南医院产科，海南 海口 570311)

子痫前期(preeclampsia，PE)是特定于妊娠期间的高血压综合征，是孕产妇、胎儿和新生儿发病率和死亡率的主要原因[1]。在怀孕期间，胎盘对于胚胎和胎儿的发育至关重要，胎盘可以将营养，呼吸气体和水分从母体组织转移到正在生长的胚胎中，在某些情况下还可以清除胚胎中的废物[2]。胎盘形成过程包括滋养细胞的侵袭、滋养细胞的血管化以建立和维持胎儿胎盘的脉管系统，以及随后的母体血管重塑为脉管系统，以及随后的母体血管重塑以获得子宫胎盘循环[3]。在胎盘的同步发育过程中，感受态细胞和绒毛外滋养层(EVT)细胞对该过程至关重要。EVT是胚胎的重要组成部分，它侵入母体的蜕膜和子宫内膜以重塑螺旋动脉[4]。如果绒毛外滋养层细胞的功能过多或不足，则可能导致妊娠的子痫前期等多种并发症。例如，子痫前期牵连EVT侵袭不足[5]。

在过去的几十年中，尽管专注于参与多种疾病发病机理的蛋白质编码基因的功能，但随着全基因组测序技术的发展，长的非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)受到了越来越多的关注[6]。LncRNA是长于200个核苷酸的RNA分子，不编码蛋白质[7]。这些lncRNA参与一系列细胞进程，例如细胞增殖[8]，凋亡[9]与分化[10]等。其机制可能通过表观遗传修饰[11]、染色质重塑[12]和通过海绵体结合miRNA[13]等。最近，各种研究已经确定，lncRNA异常表达水平可能与包括子痫前期[14, 15]在内的多种人类疾病有关。Fas是Fas细胞表面死亡受体，主要与细胞增殖凋亡相关[16]，本课题组前期研究表明，Fas在子痫前期胎盘中显著高表达[17]。

本研究通过收集子痫前期与正常对照组胎盘样本，qPCR检测LINC01410表达，并在滋养细胞中沉默其表达后检测细胞增殖、侵袭与Fas表达变化，探讨其表达量与子痫前期疾病临床意义以及对滋养细胞的功能与调控Fas的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年2月～2019年8月我院就诊的52例患者作为子痫前期组，平均年龄(29.29±4.4)岁，BMI(20.59±1.32)kg/m2，依据2019年美国妇产科医师学会(ACOG)妊娠期高血压疾病妇产科医师临床管理指南诊断为子痫前期：妊娠期间高血压的发作(血压≥140/90 mmHg，无既往高血压史)和持续的蛋白尿(≥300 mg/d)；选择46名我院女性体检者作为健康对照组，平均年龄(29.67±6.5)岁，BMI(22.39±1.44)kg/m2。本研究经海南省人民医院伦理委员会批准。两组平均年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

RNA提取试剂盒与反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，引物设计与合成由上海生工合成，LINC01410上游引物序列(5'-3')：ATTGCCCACCTGAGCTTCAT，下游引物序列(5'-3')：TTGCCAGATGGGTAAGCCAG。GAPDH上游引物序列(5'-3')：TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游引物序列(5'-3')：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。Fas上游引物：5'- CTTCTTTTGCCAATTCCAC -3'，下游引物：5'- CAGATAAATTTATTGCCACTG -3'。

Fas抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司(货号：ab133619)

1.2 实验方法

1.2.1胎盘组织收集 分娩后立即从健康孕妇或患有子痫前期的孕妇中获得胎盘，将液氮速冻并置于—80℃冰箱保存。

1.2.2RT-PCR检测胎盘组织 采用天根公司的总RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，根据 LINC01410并进行RT-PCR检测，以GAPDH作为内参，计算LINC01410的相对表达量。

1.2.3细胞培养和转染 HTR-8 /SVneo细胞购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。将HTR-8/SVneo维持在RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司)中，并在37℃和5%CO2环境下补充10%胎牛血清(购自美国Gibco公司)和1%青霉素-链霉素进行培养。通过转染LINC01410的小干扰RNA(si-LINC01410)(购自湖州河马公司，siRNA序列：TAAACTTTTACAGAATGAA)来抑制LINC01410表达。根据说明书，使用Lipofectamine 3000(购自美国Invitrogen公司)用si-LINC01410和阴性对照si-NC转染HTR-8/SVneo细胞。

1.2.4细胞增殖测定 滋养层细胞的增殖能力通过CCK8测定法(试剂盒购自日本Dojindo公司)进行评估，转染后的HTR-8/Svneo细胞，在将细胞孵育24、48或72 h后，将10 μLCCK8添加到培养基中。 最后，使用分光光度计在450 nm处测量吸光度。每组实验重复3次。

1.2.5细胞侵袭检测 将Matrigel(BD Biosciences，美国)和培养基的混合物铺展在小室的上表面，并在37°C下孵育过夜。Transwell转染后的HTR-8 / Svneo细胞重悬于无血清RPMI 1640培养基中，并置于上室中，而含有10%FBS的RPMI 1640培养基被放入下室。培养48 h后，将腔室表面上的残留细胞完全去除，将穿过膜的那些细胞固定并进行结晶紫染色。在光学显微镜下观察Transwell室。使用数字显微镜在每个腔室的3个随机视野中计算了迁移和侵袭细胞的数量，并计算平均值。每个实验重复3次。

1.2.6核质分离后qPCR检测 根据PARISTM Kit(购自赛默飞世尔科技公司，货号：AM1921`)说明书进行HTR-8/SVneo细胞细胞核与细胞质RNA分离，使用GAPDH作为细胞质对照，使用MALAT1作为细胞核对照。

1.3 统计学处理

使用SPSS 17.0 统计软件进行组间方差分析，采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC01410在子痫前期的患者与正常人胎盘组织表达

子痫前期的患者胎盘组织中LINC01410的RNA相对表达为2.564±0.169，显著高于正常对照组胎盘组织中的0.821±0.052(t=9.367，P<0.001)，见图1。

与正常组比较，***P<0.001。图1 子痫前期组患者与正常组胎盘组织中LINC01410相对表达量Fig 1 The relative expression of LINC01410 in placental tissues of patients with preeclampsia and normal groups

2.2 si-LINC01410沉默HTR-8/Svneo细胞中LINC01410表达

LINC01410的小干扰RNA(si-LINC01410)与阴性对照si-NC转染HTR-8/SVneo细胞后RT-PCR显示，si-LINC01410组LINC01410相对表达为0.183±0.015，明显低于si-NC组LINC01410相对表达1.027±0.048(t=16.79，P<0.001)，见图2。

与si-NC组相比，***P<0.001。

2.3 LINC01410沉默抑制HTR-8/Svneo滋养细胞增殖

CCK8分析显示，LINC01410沉默后48、72 h，HTR-8/SVneo细胞的增殖能力抑制(48 ht=5.272，P<0.01；72 ht=11.55，P<0.001)。见图3。

与si-NC组相比，**P<0.01;***P<0.001。图3 si-LINC01410沉默后抑制HTR-8/Svneo滋养细胞增殖Fig 3 si-LINC01410 silences the proliferation of HTR-8/Svneo trophoblast cells

2.4 LINC01410沉默抑制HTR-8/Svneo滋养细胞侵袭

Transwell实验显示，HTR-8/Svneo滋养细胞LINC01410沉默后(si-LINC01410)侵袭细胞数为(55.00±4.619)个(图4B)，明显低于阴性对照组(si-NC)侵袭细胞数(182.7±8.253)个(图4A)(t=13.50，P=0.000 2<0.001)。侵袭细胞统计图见图4C。

A：阴性对照组(si-NC)侵袭染色结果；B：LINC01410沉默后(si-LINC01410)侵袭染色结果；C：侵袭细胞数统计图；与si-NC组相比，***P<0.001。图4 LINC01410沉默抑制HTR-8/Svneo滋养细胞侵袭Fig 4 LINC01410 silence suppresses HTR-8/Svneo trophoblast invasion

2.5 LINC01410通过核内调控影响Fas表达

通过核质分离HTR-8/Svneo滋养细胞RNA后qPCR检测GAPDH、MALAT1、LINC01410。结果发现，LINC01410在细胞核中的表达为74%，大于细胞质中的表达26%，LINC01410在细胞核中相对富集,见图5A。HTR-8/Svneo滋养细胞LINC01410沉默后(si-LINC01410)，Fas mRNA表达明显下降(t=9.110，P=0.000 8),见图5B；LINC01410沉默后(si-LINC01410)，Fas 蛋白表达明显下降(t=6.550，P=0.0028)，见图5C、D。

A：核质分离后qPCR检测；B：LINC01410沉默后(si-LINC01410)qPCR检测Fas；C：LINC01410沉默后(si-LINC01410)Western blot检测Fas；D：LINC01410沉默后Fas蛋白表达统计图；与si-NC组相比，***P<0.001。图5 LINC01410沉默抑制HTR-8/Svneo滋养细胞中Fas mRNA与蛋白表达Fig 5 LINC01410 silence suppresses Fas mRNA and protein expression in HTR-8/Svneo trophoblast cells

3 讨论

较多研究表明，lncRNA在子痫前期进程中可能起关键作用[18, 19]。异常的lncRNA可能会影响滋养层细胞的增殖、凋亡和转移，并刺激子痫前期的病理胎盘发育[20]。 因此，为了阐明与子痫前期相关的lncRNA与它们的生物学功能之间的联系，对子痫前期分子机制的深入了解至关重要。研究 发现，LINC01410主要在宫颈癌[21]、甲状腺癌[22]、子宫内膜癌[23]与胆管癌[24]等肿瘤中发现其对肿瘤的增殖与侵袭功能。但在子痫前期中未见相关报道。

本研究围绕lncRNA LINC01410进行探讨，与正常对照组胎盘样本中的LINC01410的表达水平相比，子痫前期患者胎盘样品中的LINC01410上调，表明LINC01410水平升高可能与子痫前期的进展有关。然后通过转染LINC01410沉默siRNA与阴性对照载体到HTR-8/Svneo滋养细胞中，证实了LINC01410表达的沉默抑制滋养细胞增殖与侵袭作用。最后通过核质分离后qPCR检测发现，LINC01410在细胞核中富集，而LINC01410沉默后，抑制滋养细胞中Fas的mRNA与蛋白水平表达，表明LINC01410可能主要通过细胞核中转录调控影响Fas表达，进而影响滋养细胞增殖与侵袭。

然而本究也有不足之处：(1)未设置LINC01410过表达的研究进行反向验证；(2)未选择多个滋养细胞株进行重复说明；(3)未进行子痫前期的动物实验；(4)未能进一步阐述LINC01410调控Fas的互作调控机制与下游调控通路。该部分研究将后续继续进行。

本研究表明，与对照组孕妇胎盘中表达相比，子痫前期患者胎盘样品中的lncRNA LINC01410显著上调。沉默LINC01410会导致抑制作用，损害滋养细胞的细胞增殖与侵袭，富集在细胞核中，沉默后抑制Fas mRNA与蛋白表达。综上所述，LINC01410促进子痫前期发展，其作用机制可能是通过转录调控促进Fas表达增加从而促进滋养细胞增殖与侵袭。