王汉,庞士龙,赵晓宇
天津市宁河区医院骨科(天津 301500)
膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)作为一种常见、渐进性的膝骨关节退行性慢性病,临床表现主要为慢性疼痛和关节活动障碍,严重影响患者生活质量[1]。KOA在50岁以上人群发病率高,全世界范围内发病率高达3.8%[2],且女性发病率偏高[3]。KOA发病机制尚不明确,环境、遗传、机械等多种因素可共同参与膝盖软骨病变的生物过程。人体组织的代谢、功能与组织细胞的增殖、迁移、凋亡等生物学行为均与miRNA有着密不可分的关系,在肿瘤、骨关节炎等多种疾病中起着重要作用,因此分析KOA 中miRNAs的表达情况,对阐述miRNA在KOA软骨退变过程中作用、探索软骨退变的发生、发展、调控机制具有重要意义。miRNA被报道作为一种调控基因,影响骨关节炎的病理发展过程[4],在骨关节炎的早期诊断及治疗上有重要意义。研究发现,miR-9-5p可以破坏骨细胞的增殖和分化,改变细胞黏附,与软骨损伤有关[5]。Ge等[6]研究发现miR-125b-5p可以通过调控 SYVN1 诱导滑膜细胞凋亡,然而miR-9-5p、miR-125b-5p是否与KOA发生、发展有关尚不清楚,因此本研究通过检测miR-9-5p、miR-125b-5p在 KOA 患者软骨和健康软骨中的表达水平,探讨其与KOA之间的关系及意义。
1.1 一般资料 选取2015年1月至2019年1月在本院骨科就诊KOA患者124例为KOA组,其中男50例,女74例,年龄 57~78岁,平均(69.15±4.26)岁。
纳入标准:(1)符合《骨关节炎诊治指南(2007年版)》[7];(2)疼痛VAS评分≥4分;(3)3个月内未接受其他KOA相关治疗。
排除标准:(1)长期服用相关药物者;(2)因其他疾病累及膝关节者;(3)合并有肝肾功能异常的严重感染性疾病者;(4)风湿系列阳性以及妊娠和哺乳期妇女。
根据改良的ManKin[8]关节软骨评分标准,将KOA组软骨标本(重度退变软骨、中度退变软骨、轻度退变软骨)分为重度组(32例)、中度组(44例)和轻度组(48例);选取同期因交叉韧带断裂、盘状软骨损伤等在本院建卡就诊的膝关节软骨无病变的患者124例为对照组(NC组),其中男52例,女72例,年龄56~77岁,平均(67.95±4.79)岁。纳入标准:(1)病理学诊断膝关节无病变;排除标准同KOA组排除标准。两组间性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
本研究经本院道德伦理委员会批准通过,所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。
1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号:DP443),购自北京天根生化有限公司;AceQ qPCR SYBR®Green Mix(货号:Q221-01),购自南京vazyme生物公司;引物由上海生工生物公司设计合成;qRT-PCR仪(型号:CFX96),购自美国Bio-Rad公司;白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1) ELISA试剂盒(货号:A099472-48T)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6) ELISA(货号:K215741)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA(货号:K219238)、白细胞介素-8 (interleukin-8,IL-8)ELISA试剂盒(货号:A100081-48T)、软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligom eric matrix protein,COMP) ELISA试剂盒(货号:A097701-48T)购自上海扶生实业有限公司,基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13) ELISA试剂盒购自美国Abcam公司,ELX800型全自动酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
1.3 方法
1.3.1 组织来源及样品制备 (1)组织来源:分别收集在本院因KOA行关节置换术或关节镜清理手术患者的软骨组织和因交叉韧带断裂、盘状软骨损伤等行手术治疗患者自愿捐赠的健康软骨标本。(2)软骨组织RNA样品制备:在冻存软骨组织中加入Trizol 液匀浆,PBS 缓冲液洗涤;加入1 mL Trizol 裂解液,离心后取上层水相,加入等体积异丙醇,离心,弃上清,沉淀干燥后用 DEPC 水溶解得到RNA原液。Nano-Drop 2000测量记录RNA浓度。其余样品-80℃保存备用。
1.3.2 荧光定量PCR检测miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平 采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA,反转录得cDNA。采用定量PCR仪对miR-9-5p、miR-125b-5p进行扩增。qRT-PCR反应体系共10 μL:miScript SYBR®Green Mix 5 μL,cDNA(50 ng/μL)1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 3.0 μL。反应条件:95℃,90 s;95℃,30 s;63℃,30 s;72℃,15 s;40个循环。miR-9-5p、miR-125b-5p及内参U6的引物序列见表1。采用2-ΔΔCT法对血清miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平进行定量分析。
表1 qRT-PCR引物序列
1.3.3 酶联免疫法测定软骨组织中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平 采用酶联免疫法测定软骨中各炎症因子的的表达水平,检测操作严格按照试剂盒说明书进行。为控制检测质量,本次研究所有样品的检测均由检验科同一批人员在同台仪器上操作,每个样本均设3次重复。
1.4 统计学方法 利用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析,计数资料采用例(%)表示,行2检验;计量资料以均数±标准差表示,行t检验;相关性分析采用Pearson相关分析。各组数据均以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 KOA组、NC组软骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平比较 相对于NC组,KOA组患者软骨中miR-9-5p表达水平显著下调(P<0.05),miR-125b-5p表达水平显著上调(P<0.05),见表2。
表2 KOA组、NC组软骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平比较
2.2 KOA患者重度、中度、轻度组软骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平比较 相对于轻度组,重度组、中度组miR-9-5p表达水平显著降低(P<0.05);相对于中度组,重度组miR-9-5p表达水平显著降低(P<0.05)。相对于轻度组,重度组、中度组miR-125b-5p表达水平显著上升(P<0.05);相对于中度组,重度组miR-125b-5p表达水平显著上升(P<0.05),见表3。
表3 KOA患者重度、中度、轻度组软骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平比较
2.3 KOA组、NC组各炎症因子表达水平比较 轻度组、中度组、重度组KOA患者软骨中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP含量依次升高(P<0.05),见表4。
表4 KOA组、NC组各炎症因子表达水平比较
2.4 KOA患者软骨组织miR-9-5p、miR-125b-5p表达水平与各炎症因子表达水平相关性分析 KOA患者软骨组织miR-9-5p水平与IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP、miR-125b-5p水平呈负相关(P<0.05);miR-125b-5p水平与IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平呈正相关(P<0.05),见表5。
表5 KOA患者软骨组织miR-9-5p、miR-125b-5p表达与各炎症因子表达水平相关性
关节软骨由软骨基质和软骨细胞构成,在KOA病程中最早出现病理变化。软骨细胞是成熟软骨中与修复破坏软骨有关的细胞类型。有研究发现KOA患者膝关节软骨细胞明显减少[9],可能与膝关节中发生的炎症反应有关。针对其发病机制对KOA进行预防及早期诊断、治疗非常重要。全身软骨代谢异常、年龄、体重、遗传、创伤、局部炎症反应以及自身免疫和局部应力等都是 KOA 发生的相关因素。研究表明[10],miRNA在KOA发生、发展中有重要作用,miRNA的表达可调控软骨细胞的反应活性和修饰代谢过程,与KOA发生、发展相关。
研究[5]认为,miR-9-5p可通过上调nemo样激酶诱导骨骼细胞凋亡,具有损害骨细胞增殖分化、改变细胞黏附和凋亡的作用。Sun等[11]在研究中得出类似结论,miR-9-5p抑制骨细胞增殖、细胞分化和细胞黏附。Chen等[12]发现miR-9-5p在骨关节炎小鼠模型中表达下调,可通过调控骨关节炎小鼠的固生蛋白C,促进软骨重塑,抑制软骨细胞凋亡,过表达miR-9-5p可改善小鼠的软骨重塑。Li等[13]研究证明,过表达miR-9-5p可促进软骨细胞中间充质干细胞和高迁移能力的间充质干细胞的迁移能力。本研究发现KOA患者软骨细胞中miR-9-5p相对于正常软骨细胞,表达显著下调,提示miR-9-5p可能与KOA的发生有关。进一步研究发现,miR-9-5p的表达水平在轻度组、中度组、重度组KOA患者软骨细胞中依次下降,说明miR-9-5p在KOA患者软骨中的表达水平与患者病情有关,一定程度上可能反映患者病情严重程度。
徐永明等[14]研究发现miR-125a-5p与大鼠的终板软骨退变有密切联系。Ge等[6]研究发现miR-125b-5p在关节炎患者滑膜细胞中表达量显著升高,提示miR-125b-5p的表达与关节炎的发生有关。与Ge等研究结果相似,本研究发现,miR-125b-5p在KOA患者软骨细胞中高表达,说明miR-125b-5p可能与KOA的发生有关,并且miR-125b-5p在轻度组、中度组、重度组KOA患者软骨细胞中表达水平依次升高,说明miR-125b-5p的表达水平与KOA患者的病情有关。
参与KOA病情发展的细胞因子有很多,Rasheed等[15]研究发现miRNA-125b-5p可通过调控MMP-13、IL-6等在内的炎症因子表达,参与KOA过程中炎症反应进展。IL-1可通过刺激滑膜细胞产生胶原酶和酪蛋白酶[16],刺激软骨细胞产生MMP,起到快速促炎症作用[17]。孙文才等[18]对KOA患者血清及关节液中细胞因子表达水平研究发现,KOA患者血清和关节液中细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平异常增高。研究显示[19],IL-8可通过抑制软骨基质的多种功能活动加速膝关节炎症病变。邓超等[20]研究发现,接受电针治疗后患者疼痛评分、情绪评分显著降低,血清中IL-8含量显著降低,提示血清IL-8含量的降低可能与KOA病情减轻有关。TNF-α尽管在骨关节炎关节组织中检测水平很低,也是KOA中基质退变的一个重要介质,是滑膜炎症的关键细胞因子。李洪涛等[21]用研究发现MMP-13表达下调可以抑制炎性因子的释放、阻止软骨基质的降解,进而保护受损的关节软骨,促进关节软骨的结构和功能的恢复,说明MMP-13表达下调与KOA患者病情恢复有关。COMP是透明软骨的重要组成成分,主要由软骨细胞和滑膜细胞分泌,姚丽等[22]研究表明,大鼠膝骨关节炎模型膝关节滑膜组织中COMP含量显著高于对照组,提示COMP表达的升高参与诱导软骨降解,该变化与骨关节滑膜组织炎症有关。本研究发现IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP在KOA患者软骨组织中表达均显著上升,且在轻度组、中度组、重度组中含量依次增加,提示KOA患者均存在一定程度炎症反应,且随病情恶化,炎症程度增加。Pearson相关分析发现KOA患者软骨组织中miR-9-5p水平与miR-125b-5p、IL-1等炎症指标水平呈负相关,miR-125b-5p与IL-1等炎症指标水平呈正相关,说明miR-9-5p、miR-125b-5p可能通过影响KOA患者炎症反应情况,影响KOA患者病情进展。
综上所述,miR-9-5p在KOA患者软骨中低表达,miR-125b-5p在KOA患者软骨中高表达,两者可能与KOA疾病发生、发展有关。本研究的不足之处在于样本量少,研究范围局限,因此miR-9-5p、miR-125b-5p在KOA患者软骨中的表达和意义的相关研究还需加大样本量扩大规模进一步深入研究。