敞开式离子化质谱技术及其在微生物分析中的应用

胡莉莉，何芷晴，吴春梅，贾珊珊，杨玉磊，张 玫*，雷海民*

(1.北京市北分仪器技术有限责任公司，北京 100095；2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000； 3.北京中医药大学 中药学院，北京 102488)

质谱(Mass spectrometry,MS)技术具有灵敏度高、分辨率高、分析速度快、样品用量少等优势，目前在各个领域均有广泛应用[1-4]。离子源是质谱的重要组成部件，2004年出现的敞开式离子化质谱(Ambient ionization mass spectrometry,AI-MS)是离子化技术领域的重大突破。AI-MS技术可在大气压环境中直接对样品或样品表面物质进行分析，无需或只需很少样品前处理步骤，具有实时、简便、快速、高通量等诸多优点。随着AI-MS技术的不断发展，其检测灵敏度已逐渐可与传统MS相媲美。目前，AI-MS已经在食品药品检测、环境监测、爆炸物检测、分子成像等诸多领域得到了广泛应用[5-6]。本文将重点介绍目前使用较为广泛的AI-MS离子源及其在微生物分析中的应用。

1 敞开式离子源的技术分类与原理特点

根据离子化原理与方法不同，AI-MS技术大体可分为喷雾型、放电型和以气、热等辅助激光解吸的复合型3类。下面对3类AI-MS技术装置和原理的特点进行介绍：

1.1 喷雾型敞开式离子化技术

喷雾型敞开式离子化技术通过溶剂蒸发和尖端效应生成离子。Cooks团队发明的解吸电喷雾离子化(Desorption electrospray ionization,DESI)方法是喷雾型AI-MS技术的典型代表[7]，纳喷解吸电喷雾离子化(Nanospray desorption electrospray ionization,nano-DESI)技术则具有更佳的检测灵敏度。Prosolia公司于2005年将DESI商品化，如今已迭至第二代DESI 2D,并推出了Flowprobe对待测物质进行高效微萃取，现已成功应用于疾病筛查与微生物分析。陈焕文教授提出了萃取电喷雾离子化(Extractive electrospray ionization,EESI)技术[8]，随后又开发了中性萃取电喷雾离子化[9]技术，可分别实现复杂液体样品和固体样本的高时效性分析。目前DESI和EESI均已被应用于微生物研究[10]，同时已基于EESI实现了多种技术延伸，比如小型化[11]和内部萃取电喷雾离子化技术[12]的开发等。

Haddad提出的解吸声波喷雾离子化(Desorption sonic-spray ionization,DeSSI)技术，即后来的简易声波喷雾离子化(Easy ambient sonic-spray ionization,EASI)[13]的装置，与DESI类似但无需高温高压。类似的还有文丘里-简易声波喷雾离子化[14]和精简型-简易声波喷雾离子化[15]。EASI类离子源不依赖于电子、辐射、光、热组件，降低了仪器硬件成本，目前在多个领域均有应用。纸喷雾离子化(Paper spray ionization,PSI)是最为简易的常压质谱技术之一，欧阳证教授团队对纸基进行了二氧化硅修饰[16]；本课题组采用商品化半透膜或合成的分子印迹膜代替原有的纸基发展出的膜喷雾(Membrane electrospray ionization,MESI)[17]和印迹膜喷雾(Molecularly imprinted membrane electrospray ionization,MIM-ESI)[18]，以及融入了纳米技术的纸基修饰都进一步提升了纸喷雾的分析能力[19-20]。目前基于纸喷雾、膜喷雾，已成功实现了细菌种属鉴别、细菌耐药性快速检测、细菌毒素快速检测等多项微生物相关应用[21-22]。

1.2 放电型敞开式离子化技术

放电型敞开式离子源的离子化机理主要包含“质子转移”和“电子转移”等离子分子反应过程。Cody团队提出的实时直接分析(Direct analysis in real time,DART)离子化技术是该类型的典型代表[23]。目前DART已实现商品化，在微生物鉴定方面显示出快速、简便、高通量的特征[24-25]。Cooks教授开发的低温等离子体探针(Low temperature plasma,LTP)技术，可直接将固体基质表面样品分子解吸并电离进行质谱检测[26]，并可应用于mini-MS[27]。低温等离子体对样品损伤小，便于样品表面的准确定位，在质谱成像和生物活体原位研究等领域具有重要价值。快速蒸发离子化质谱技术(Rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)为生物组织实时体内分析而设计[28]，有两支镊子形手持电极探针，可将微量细菌置于射频电流下获得微生物质谱指纹图谱。在REIMS基础上发展而来的环境激光解吸离子化(Ambient laser desorption ionization,ALDI)技术在形态精度和分析通量上均得到了提高[29]。

1.3 以气、热等辅助激光解吸的复合型离子化技术

Shiea等[30]提出的电喷雾激光解吸离子化(Electrospray laser desorption ionization,ELDI)技术，是将激光解吸附和电喷雾相结合的电离策略，首次实现了无需基质辅助仅利用激光解吸进行完整的蛋白质谱分析。Rezenom等[31]提出的红外激光辅助解吸电喷雾离子化(Infrared laser-assisted desorption electrospray ionization,IR-LADESI)技术，多用于对生物液体样品的分析。此外还有Sampson等[32]提出的具有更高灵敏度的基质辅助激光解吸电喷雾离子化(Matrix-assisted laser-desorption electrospray ionization,MALDESI)技术，可同时满足液体和固体样品的检测需求[33]，以及Nemes等[34]提出的采用不同激光源的激光消融电喷雾离子化(Laser ablation electrospray ionization,LAESI)技术等。基质是一类对微生物生理生化等生物学过程影响很大的化学物质，无需基质辅助的质谱离子化技术将大幅度扩展质谱技术在微生物领域的研究应用。

2 敞开式离子化技术在微生物领域的应用

近年来基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)已成功应用于微生物鉴定[35]，然而尚无法实现快速分析，也缺乏菌株分型能力。随着AI-MS的兴起，其操作简便、快速检测的优势越发受到人们青睐，在微生物领域的应用不断得到拓展，表1～3总结了目前已报道的应用于微生物检测的敞开式离子化方法。下面逐一详细介绍。

2.1 微生物鉴定与分型

细菌的鉴定分型在临床诊断、公共卫生、环境检测、药学、食品等诸多领域具有重要意义。在喷雾型AI-MS技术中，DESI可在环境条件下从完整微生物中快速获得细菌种属鉴定结果实现亚种分类[36]。Hamid等[37-38]采用PSI-MS结合统计学算法在无需样品制备的情况下，对细菌、真菌进行了鉴定分类。Cooks课题组建立的接触喷雾离子化(Touch-spray ionization,TSI)质谱[39-40]、本课题组研发的注射器喷雾质谱(Syringe spray mass spectrometry,SS-MS)方法[41]，均可实现细菌种属分类鉴定。SS-MS还可监测细菌对外界刺激反应的动态过程，直接分析细菌对外界刺激做出的反应。捕获微生物对环境变化和刺激的动态响应对于理解微生物的适应性和进化非常重要，对于抗生素药物开发和微生物组学研究具有实际意义。

细菌脂肪酸分析常被用于细菌鉴定[42]，敞开式离子化质谱可分析细菌脂肪酸，无需样本前处理。在放电型AI-MS技术中，Pierce等[43]采用DART-TOF MS对完整的细菌细胞进行了脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters,FAME)离子化的研究；Cody[44]通过DART-TOF MS技术对17种不同的干酵母菌株进行了区分。Musah等[45]利用DART-MS衍生指纹图谱结合化学计量学进行数据处理实现了物种识别和分类，仅根据微生物的代谢产物即可判断物种间的相似性和差异性。Cooks课题组[46]通过采用LTP-MS直接检测细菌样品中的脂肪酸乙酯(Fatty acid ethyl esters,FAEE)，成功区分了16种不同细菌。Strittmatter等[47]就REIMS作为细菌和真菌通用鉴定系统的适用性进行了研究，Cameron等[48]使用自动化、高通量的REIMS智能平台直接分析人类粪便样本，鉴定到可能来自细菌的磷脂分子。

表1 用于微生物鉴定与分型的敞开式离子化方法Table 1 Ambient ionization methods for microbial classification and identification

2.2 微生物代谢物与生物膜分析

微生物代谢产物研究可助力药物发现，目前基于DESI-MS开发了诸多应用，例如：Cooks课题组成功鉴定到枯草芽孢杆菌产生的抗生素环脂肽Surfacetin[49]；Pruski等[50]用棉签拭子进行了粘膜代谢组分析；Rodrigues等[51]进行了放线菌次生代谢产物的表征;Lanekoff等[52]对琼脂平板上粘球菌代谢物和脂质的空间分布进行了分子水平的研究;Rath等[53]开展了细菌代谢物的非靶向分析；Nguyen等[54]使用DESI-MS/MS技术将种属特异性分子与相关基因功能形成联系；Zhang等[55]直接测定了不同细菌的脂类。此外，Hsu等[56]采用Flowprobe-MS对30余种微生物代谢产物进行检测，成功鉴定到包括不同种属细菌的代谢产物。

生物膜又称生物被膜，是微生物学领域的前沿之一。Ravindran等[57]采用铜绿假单胞杆菌为研究模型，建立了水中有毒重金属污染的快检方法。Li等[58]使用DART-MS检测了医疗器械材料的内毒素污染情况。

2.3 微生物质谱成像

目前质谱成像技术已成为质谱研究的一大热点。Yan等[59]使用直接生物转化离子质谱(Direct biotransformation-ion mobility mass spectrometry,DiBT-IMMS)方法对琼脂平板细菌菌落进行了分析。刘虎威教授团队利用EASI-MS描述了蓝藻的衰老过程[60]。Angolini等[61]采用EASI-MS和DESI-MS在培养物表面直接进行代谢产物的空间分布研究。李航等[62]采用LAESI-MS成像模拟了Kirby-Bauer实验中微生物与抗生素的相互作用，研究了抗生素对细菌生长的抑制作用。Stopka等[63]采用LAESI-IMS-MS方法对未感染根段和完整根瘤进行了对比成像分析，揭示了关键代谢物在皮质和感染区域的空间分布。

表2 用于微生物代谢物和生物膜分析的敞开式离子化方法Table 2 Ambient ionization methods for bacterial metabolite analysis and biofilm analysis

表3 用于微生物质谱成像的敞开式离子化方法Table 3 Ambient ionization methods for mass spectrometry imaging of microbial

3 总结与展望

目前基于微生物自身的分子特征，研发具有针对性的新型敞开式电离技术是质谱领域的研究热点。敞开式离子化质谱技术由于具有原位无损分析和快速便捷等诸多优点，很大程度上契合了微生物研究的需求，展现出巨大的发展前景。但目前的技术多数仍受制于质谱设备的庞大体积和高昂成本。现今，敞开式离子化技术结合便携式质谱仪已成为质谱快速分析的重要发展方向，为质谱的现场普查筛选应用提供了可能。