半枝莲抑制大肠癌干细胞自我更新及成瘤能力

张晶晶 方 翌 刘丽雅 沈阿灵 沈志清 张 铃 彭 军 魏丽慧 陈友琴

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.美国凯斯西储大学医学院，俄亥俄州 克利夫兰 44106）

据美国癌症协会2020年统计数据显示，大肠癌（colorectal cancer，CRC）在致死性癌症中占第三位，美国每年有超过150万新发病例，其中死亡人数高达 1／3［1］。研究表明，肿瘤干细胞是癌症治疗后复发、转移和耐药的关键因素，这些细胞在实体瘤组织中占比较小，并具有自我更新、高成瘤能力、多向分化等生物学特性［2-3］。其中，自我更新是肿瘤干细胞的基本特征，指其通过对称或不对称分裂产生至少一个保留干细胞特性子细胞的过程，可使癌细胞无限增殖，从而影响肿瘤发生发展［4］。因此，如何抑制大肠癌干细胞的自我更新和成瘤能力及其机制研究，对防治大肠癌具有重要意义。半枝莲（Scutellaria barbataD.Don）系唇形科黄芪属植物，功效清热解毒、化瘀散结，对大肠癌、胃癌等恶性肿瘤均有良好疗效［5］。课题组前期实验表明半枝莲具有降低大肠癌干细胞比例及诱导其调亡的作用［6-7］，但对大肠癌干细胞自我更新功能和体内成瘤能力的作用及机制尚未阐明。因此，本课题研究半枝莲对大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力的影响及可能的调控通路。

1 实验材料

1.1 药物和细胞株 半枝莲购自福建中医药大学国医堂；人源SW480大肠癌细胞株购自上海中科院细胞库。

1.2 实验动物 4～5周龄SPF级BALB／c雄性裸鼠，8只，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，实验动物合格证号：2015000553480。

1.3 实验试剂 DMEM／F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、B-27、Antibiotic-Antimycotic、StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；Leibovitz’s L-15 培养基（江苏凯基生物公司）；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，FGF-basic）（美国 Peprotech 公司）；一抗 Nanog、SRY 同源框 2（SRY homology box 2，SOX2）、八聚体结合转录因子（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、GAPDH、β-actin 及鼠二抗、兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.4 实验仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2培养箱、低速离心机（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分选型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；高内涵细胞分析系统（美国BD Biosciences公司）；电泳仪、电泳槽、化学发光凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 常用试剂配制

2.1.1 半枝莲溶液的配制 参照文献［6］中的方法制备半枝莲乙醇提取物，用PBS和DMSO按1∶1比例配制成浓度为500 mg／mL的半枝莲溶液，超声30 min，待溶解后分装，并储存于-20℃。

2.1.2 大肠癌干细胞培养基配制 在不含胎牛血清的 DMEM／F12培养基中加入 20 ng／mL EGF、20 ng／mL FGF-basic、1×B-27 和 1%Antibiotic-Antimycotic，分装储存于0℃。

2.2 大肠癌干细胞培养 采用侧群细胞分选法分离大肠癌干细胞［8］，收集大肠癌干细胞后用PBS清洗1次，加入配置好的干细胞培养基，并按照1.5×103个／mL密度接种在超低粘附6孔板中培养。

2.3 克隆球实验 将大肠癌干细胞按3×105个／mL的密度接种于超低黏附6孔板培养过夜后，用不同浓度的半枝莲（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干预 24 h，然后消化离心收集细胞重新按5×102个／mL的密度分别接种于超低粘附6孔板，在干细胞培养液中继续培养10 d。期间，每隔3 d添加1 mL干细胞培养基。最后移至96孔板，采用高内涵细胞分析系统在10×物镜下，以10×10的模式进行图片采集，并进行计数。

2.4 皮下移植瘤模型 将BALB／c雄性裸鼠饲养于SPF级动物房微生物隔离笼中，添加无菌垫料、饲料、水。适应性饲养1周后进行实验。大肠癌干细胞经半枝莲（0、0.5 mg／mL）干预后，调整细胞数，用PBS（50 μL）和基质胶（50 μL）混合液重悬，采用皮下注射法，按 1 000 个细胞 ／只（100 μL／只），注射到小鼠的右腋下（对照组4只，半枝莲0 mg／mL；实验组4只，半枝莲0.5 mg／mL）。接种后每日观察小鼠状态及瘤体生长情况，49 d后用过量异氟烷处死小鼠，剥除所有肿瘤并称重。动物实验均严格按照《福建中医药大学实验动物中心动物实验协议书及承诺书》中的标准进行。

2.5 Western blot检测 Nanog、SOX2、OCT4、p-Akt、Akt蛋白的表达 用不同浓度半枝莲（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干预大肠癌干细胞24 h后，弃上清，用预冷的PBS清洗2次，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂），在冰上裂解30 min以提取总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液（5×SDS-PAGE）使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE电泳（90 V，45 min；120 V，55 min），接着用 PVDF 膜进行转膜（110 V，60 min）。转膜结束加封闭液封闭1 h，按目的蛋白分子量大小进行裁膜，并加入对应的一抗 Nanog（1∶2 000）、SOX2（1∶1 000）、OCT4（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃摇床孵育 14～16 h。一抗孵育结束后用1×TBST清洗3次，每次10 min。再加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）常温孵育1 h，二抗孵育后用1×TBST清洗3次，每次10 min。用ECL化学发光法显影，在化学发光凝胶成像仪上检测蛋白表达。

2.6 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件分析数据。计量资料以（±s）表示，符合正态分布且方差齐，用t检验；不符合正态分布，则用Wilcoxon秩和检验。多组数据之间比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 半枝莲对大肠癌干细胞体外成球能力的影响

在倒置显微镜下观察克隆球数目，可见0 mg／mL组细胞生长密集，成球状况良好，而不同浓度半枝莲干预后克隆球数目较0 mg／mL组均明显减少（P＜0.05），且随浓度的增加克隆球数目递减，见图1。

图1 半枝莲对大肠癌干细胞体外成球能力的影响（×100）

3.2 半枝莲对大肠癌干细胞体内成瘤能力的影响

皮下接种后，随时间推移，可见对照组裸鼠瘤体体积逐渐增大，而实验组瘤体生长较为缓慢，49 d后剥除瘤体，发现实验组的瘤体明显比对照组小，见图2。进一步称量瘤体质量，发现实验组的瘤体质量较对照组显著降低（P＜0.05）。

图2 半枝莲对大肠癌干细胞体内成瘤能力的影响

3.3 半枝莲对 Nanog、SOX2、OCT4蛋白表达的影响 与0 mg／mL组相比，不同浓度的半枝莲干预24 h后均能明显下调Nanog、SOX2、OCT4的蛋白表达水平（图3），且抑制作用随着半枝莲的浓度增加而变强。

3.4 半枝莲对p-Akt、Akt蛋白表达的影响 与0 mg／mL组相比，不同浓度的半枝莲干预24 h后，均能明显抑制Akt的磷酸化，见图4。

图3 半枝莲对大肠癌干细胞Nanog、SOX2、OCT4蛋白表达的影响

图4 半枝莲对大肠癌干细胞p-Akt、Akt蛋白表达的影响

4 讨论

大肠癌是临床常见的难治性消化道肿瘤，目前临床疗法以手术切除和化疗为主［9］，但术后易发生脏器转移，导致患者生存率降低［10］；化疗又伴随毒副作用，严重危害患者生存质量。针对上述局限性，近年来中医药抗肿瘤研究逐渐兴起。中医药在防治癌症方面具有多组分、多靶标、副作用少等独特的优势，但目前研究多集中在抗肿瘤细胞方向，对肿瘤干细胞的研究较少，而肿瘤干细胞才是癌症转移的关键［11］。肿瘤干细胞是实体瘤中一小群明显不同的细胞亚群，相当于癌组织里的“种子细胞”，通常处于休眠状态，可逃脱外界伤害，当环境适宜时则恶性增殖，并易产生远处转移，从而导致肿瘤复发。因此，研究能抑制大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力的中药及其调控机制，有望解决大肠癌复发和转移这一难题。

半枝莲是临床常用抗癌中药，研究表明它含有黄酮、多糖、二萜等活性物质，这些有效成分可调节免疫、抑制癌细胞生长和肿瘤血管生成，从而发挥抗肿瘤功效［12-16］。克隆球实验结果显示，相比0 mg／mL组，半枝莲干预后大肠癌干细胞成球数目明显减少；裸鼠皮下移植瘤实验显示，实验组大肠癌干细胞所形成的瘤体质量较对照组显著减轻。体内外实验综合表明半枝莲可抑制大肠癌干细胞的体外自我更新能力和体内成瘤能力。

据报道，肿瘤干细胞的自我更新和成瘤能力受到多条信号通路调控，其中Akt信号通路的异常活化是经典的转导通路之一［17-18］。Akt蛋白属于AGC激酶家族，最初被描述为病毒癌基因的人类同源物，可调控细胞代谢、增殖、癌症发生等生理病理过程［19-20］。研究表明，活化的Akt存在于大肠癌组织中，且与大肠癌患者预后不良有关［21］。当Akt通路受细胞外信号刺激时，可发挥细胞内下游效应子功能，通过聚集Akt并转移到质膜后，在磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）和雷帕霉素复合物激酶2（mTORC2）的活化作用下，促进磷酸化，最终活化的Akt会进一步诱导多种底物磷酸化，从而维持肿瘤干细胞的自我更新和成瘤能力［22］，该途径中重要的下游靶基因主要有 Nanog、SOX2、OCT4 等［23］。 Nanog 是一种同源结构域转录因子，在维持干细胞多能性和自我更新中起着重要作用［24］。ALMOZYAN 等［25］发现下调PD-L1可通过激活Akt信号通路靶向Nanog，从而抑制乳腺干细胞的体外自我更新能力和体内成瘤能力。SOX家族涉及癌细胞生长迁移、克隆球形成和成瘤能力［26］，其中，SOX2是维持肿瘤干细胞特性所必需的转录调控子［27］，ZHOU 等［28］发现过表达miR-135b可通过激活AKT／mTOR途径增加SOX2的表达，并最终促进胰腺癌干细胞自我更新和成瘤能力。OCT4也调控干细胞多能分化和自我更新［29］，ZHU等［30］发现通过靶向转录因子ZIC2可激活OCT4，促进克隆球形成及小鼠异种移植瘤生长，从而驱动肝癌干细胞自我更新和成瘤能力。

因此，本课题通过检测与大肠癌干细胞中自我更新和成瘤能力相关标志物Nanog、SOX2、OCT4及Akt信号通路中p-Akt、Akt蛋白的表达，探讨半枝莲抑制大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力的分子机制。本研究结果显示，经半枝莲干预后，大肠癌干细胞中Nanog、SOX2、OCT4的表达明显下调，且Akt的磷酸化被显著抑制。提示通过抑制Akt信号通路的活化可能是半枝莲抑制大肠癌干细胞自我更新和成瘤能力的重要机制之一。