抗酸染色与PCR-荧光探针法在石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测的比较

吴俊峰，任淑婷

（西安交通大学医学部基础医学院，陕西 西安 710000）

0 引言

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性肉芽肿性病，以肺结核病最为常见，但亦见于全身各脏器和器官，危害性极大[1]，是严重危害人类健康的全球性传染病之一[2]。近年来，我国结核病的发病率持续上升，其发病率及死亡率在我国法定传染病中居首位，是我国重点防治疾病之一[3]。因此，早期准确诊断是结核病患者得以及时治疗的关键，而提高诊断技术对早期发现结核病患者至关重要[4]。目前，医院实验室检测结核分枝杆菌的方法既有传统的抗酸染色、细菌培养等技术，又有免疫学诊断技术和各种PCR的衍生技术[5]。本次实验采用抗酸染色与PCR-荧光探针法同时检测经福尔马林固定、石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌，比较两种方法检测结果的一致性，探讨两种方法在结核病病理诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究资料

本组资料选自2018年1月至2019年10月西京医院疑似结核患者，共543例，年龄1～90岁，平均（48.29±16.17）岁，其中男性231例，女性312例，检测标本类型包括肺组织、淋巴结、肝脏组织、肾脏组织、软组织包块、大网膜、胰腺、胸腹膜、子宫、关节滑膜、椎间盘、胸椎及腰椎、前列腺组织、附睾等，所有组织标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，3μm切片，HE染色、抗酸染色及PCR-荧光探针法检测。

1.2 试剂与方法

1.2.1 抗酸染色试剂与方法

抗酸染色试剂盒购于珠海贝索生物技术有限公司，采用Ziehl-Neelsen法,操作步骤如下：①切片经脱蜡后滴加石碳酸复红溶液，微火加热5～10min，重复滴加并加热；②冷后水洗，滤纸吸干水分；③滴加酸性酒精溶液脱色1～2min；④水洗后加亚甲基蓝溶液20～30s；⑤水洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.2.2 PCR-荧光探针法试剂与方法

PCR-荧光探针法试剂盒购于湖南圣湘生物科技有限公司，操作步骤如下：①取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；②根据待测样本、阴性对照、阳性对照和阳性参照品A、B、C、D，按比例取相应量的反应液、酶混合液，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用；③在样本中加入2～3倍体积的4%NaOH溶液，震荡混匀后静置液化30min。取液化后的样本500μL于1.5mL离心管，12000r/min，离心3min，吸除上清；加入1mL无菌生理盐水重悬沉淀，12000r/min，离心3min，吸除上清；加入50μL核酸释放剂，100℃处理10min，12000r/min，离心3min，上清作为待测样本备用；④每个PCR反应管中依次加入待测样本、阴性对照、阳性对照和阳性参照品各5μL；⑤每管加入PCR混合液40μL，盖上管盖，2000r/min离心30s；⑥将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照、阳性参照品及未知样本，并设置样本名称；⑦选择荧光检测通道，50℃UNG酶反应2min，94℃Taq酶活化5min，94℃变性15s 45次，57℃退火，延伸及荧光采集30min 45次，25℃仪器冷却10min。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验进行分析，组内比较采用行×列表资料的χ2检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗酸染色阳性结果

结核分枝杆菌为长1.3～3.5μm，宽0.3～0.5μm杆菌，可有弯曲，没有鞭毛和芽孢，镜下抗酸菌或呈成群杆菌，或呈小点状（退变时），菌量少时可见每2～3个细菌连成“V”、“Y”、“T”等形状的特有集结，呈鲜红色，其他细菌及细胞呈蓝色（图1）。

图1 抗酸染色阳性结果图

2.2 抗酸染色与PCR-荧光探针法染色结果（表1）

2.3 抗酸染色与PCR-荧光探针法结果的比较

在543例疑似结核患者病例中，抗酸染色与PCR-荧光探针法同为阳性者53例，同为阴性者327例，抗酸染色阴性，PCR-荧光探针法阳性者158例，抗酸染色阳性，PCR-荧光探针法阴性者5例，两种方法符合率为69.98%，抗酸染色阳性检出率为10.68%，PCR-荧光探针法阳性检出率为38.86%，差异有显著性（P<0.001,见表2）。

2.3.1 抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同性别MTB阳性率比较

抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同性别MTB的阳性检出率差异均有统计学意义（P均<0.001，见表3）且PCR-荧光探针法在不同性别患者的MTB阳性检出率均高于抗酸染色法。

2.3.2 抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同年龄MTB阳性率比较

抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同年龄MTB的阳性检出率差异均有统计学意义（P均<0.05，见表4）且PCR-荧光探针法在不同年龄患者的MTB阳性检出率均高于抗酸染色法。

2.3.3 抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同组织来源MTB阳性率比较

除胸壁、胸膜、腹膜及肝组织外，抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同组织来源MTB的阳性检出率差异均有统计学意义（P均<0.05，见表5）且PCR-荧光探针法在不同组织来源患者的MTB阳性检出率均高于抗酸染色法。

2.4 187例明确临床诊断结果中两种方法Youden指数的比较

见表6、表7。

表1 抗酸染色与PCR-荧光探针法染色结果

表2 抗酸染色法与PCR-荧光探针法检测结果的比较

表3 两种方法检测不同性别MTB阳性率比较[n(%)]

表4 两种方法检测不同年龄MTB阳性率比较[n(%)]

表5 两种方法检测不同组织来源MTB阳性率比较[n(%)]

表6 抗酸染色法的Youden指数

表7 PCR-荧光探针法的Youden指数

3 讨论

结核病病理形态学主要表现为坏死性肉芽肿性炎，中央为干酪样坏死，外围由类上皮细胞、朗格汉斯巨细胞、反应性增生纤维母细胞及淋巴细胞构成[6]，但在实际工作中，结核病的病理变化既有典型的病变，也常出现不典型的病变，给结核病的诊断造成困难，因此，找到病灶组织中结核分枝杆菌成为病理学诊断的重要依据[7]。

抗酸染色是检测结核分枝杆菌的传统方法，可用于痰涂片和组织切片染色，其方法简单、成本低、特异性高，但是灵敏度低，易造成假阴性[8]。PCR法是根据DNA复制原理而设计的体外DNA或RNA扩增方法,优点是具有高度的敏感性和特异性，且操作较简单，已成为结核诊断的最佳检测方法[9]。本实验对来自西京医院的543例疑似结核患者同时进行抗酸染色和PCR-荧光探针法检测，比较两种方法的阳性检出率及符合率。结果显示：抗酸染色法阳性检出率为10.68%（58/543），PCR-荧光探针法阳性检出率为38.86%（211/543），两者符合率为69.98%，其中抗酸染色法阳性而PCR-荧光探针法阴性者有5例，分析其原因可能为：①抗酸染色法不仅使结核分枝杆菌呈阳性，非结核分枝杆菌如麻风杆菌也会呈阳性；②若样本含菌量极少，经修片、切片后抗酸染色切片内含少量菌，PCR组织内可能会不含菌。抗酸染色法阴性而PCR-荧光探针法阳性者158例，分析其原因可能为：①结核分枝杆菌较小，在镜下观察有一定的难度，具有观察者的主观差异，尤其是活检小标本菌量少的易漏诊[10]；②若取材组织来自坏死灶中心特别是陈旧性坏死中心，而非肉芽肿内或干酪样坏死灶周围，常因中心缺氧，不利于细菌生长，难以查见；③结核分枝杆菌在较陈旧或经过治疗的病灶内可见短杆、颗粒及弯杆状的变异形态，易误诊。

本文还比较了不同性别及年龄对抗酸染色和PCR-荧光探针法检出率的影响，结果显示：不同性别及年龄对抗酸染色和PCR-荧光探针法结果无明显影响；同时，本文还对来自不同性别、年龄及组织来源的患者标本采用两种方法检测的阳性检出率进行比较，结果显示：在不同性别及年龄的患者标本中，PCR-荧光探针法阳性检出率均显著高于抗酸染色法；在不同组织来源中，除胸壁、胸膜、腹膜及肝组织外，抗酸染色与PCR-荧光探针法检测不同组织来源MTB的阳性检出率差异均有统计学意义且PCR-荧光探针法阳性检出率均显著高于抗酸染色法。胸壁、胸膜、腹膜及肝组织等组织来源可能因标本例数太少导致两种方法的阳性检出率无统计学意义。

543例疑似结核患者中已知明确临床诊断结果者共187例，其中阳性105例，阴性82例，PCR-荧光探针法Youden指数（J=0.5245）显著高于抗酸染色法Youden指数（J=0.2095）。

综上所述，PCR-荧光探针法检测石蜡包埋组织中的结核分枝杆菌，阳性检出率显著高于抗酸染色法，具备较高的诊断价值，可结合病理组织学特点为临床提供可靠的诊断依据。