高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中9种禁用生物碱

吕小会，罗辉泰，黄晓兰，张秋炎，朱志鑫，吴惠勤

(1.广东工业大学，广东 广州 510006；2.广东省科学院，广东省测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070)

随着经济的日益发展和生活水平的不断提高，化妆品市场展现出蓬勃生机，尤其对女性来说，化妆品已经成为一种不可缺少的日常用品[1]。在需求增加的同时，人们对化妆品质量提出了自然、健康的要求。近年来，将作用温和、刺激性小、安全性高的植物提取物作为添加剂应用于化妆品中已成为新产品研发的热点[2-4]。在化妆品中添加植物提取物既可以保留植物天然药效成分的持久稳定、安全可靠，又具有美容、营养、保健的作用[5]。从化妆品中使用的天然植物剂型来看，一般采用萃取液或浓缩物直接进行调配，这些植物提取物中除了有益于人体的天然成分外，还可能会引入其他物质，例如有毒生物碱。这是一类主要存在于植物中的含氮碱性有机化合物，是植物次生代谢产物中的一类，具有显著的药理活性和毒性[6]，长期使用含有毒生物碱类物质的化妆品会给消费者的身心健康带来极大伤害[5,7-8]。欧盟化妆品法规[9]和我国《化妆品安全技术规范》[10]明确将部分有毒生物碱列为禁用组分。《中国已使用化妆品名称原料目录(2015版)》中显示，允许在化妆品中使用的8 000多种成分中有2 000多种属于天然植物提取物，而国内针对化妆品中禁用生物碱的相关检测方法及标准却明显滞后，很多在《化妆品安全技术规范》中规定的禁用生物碱还缺少相应的检测方法，在最新发布的国家标准方法[11]中也没有全部涵盖。

有关生物碱检测的报道主要集中在血液、尿液、天然植物、食物等基质中[12-18]，检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[19]、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法[9,13-14,16,20]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[15,21]。其中，HPLC对复杂样品具有高分离能力，但检出限通常在100 μg/kg以上，不适合痕量检测，同时仅以保留时间进行定性分析存在不足，当目标物浓度较低时，基质干扰严重、选择性差、易出现假阳性结果[22]；GC-MS适用于挥发性和半挥发性成分的分析，而大部分生物碱属于难挥发化合物；HPLC-MS/MS既具有HPLC的高分离能力，又具有质谱的高选择性、高灵敏度以及能提供相对分子质量和结构信息的优点。因此，文献报道主要采用HPLC法[19,23-24]和HPLC-MS/MS法[8,20,25]检测化妆品中生物碱，但所涉及的生物碱种类较少。

本文拟针对《化妆品安全技术规范》中明确规定的禁用有毒生物碱种类，采用HPLC-MS/MS法同时测定化妆品中9种生物碱(士的宁、毛果云香碱、西伐丁、那可丁、山梗菜碱、阿托品、东莨菪碱、麻黄碱、毒扁豆碱)，并在样品前处理过程中，将除脂与净化同步进行，希望为化妆品中禁用生物碱的检测及监控提供科学依据和技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1200 SL Series HPLC-6410B Triple Quard MS液相色谱-串联四极杆质谱仪：美国 Agilent公司产品；KQ3200型台式机械超声波清洗器：东莞市科技超声波设备有限公司产品；H1850离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；XW-80A快速混匀器：海门市麒麟医用仪器厂产品。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司产品；甲酸：LC-MS级，美国Sigma公司产品；正己烷：分析纯，广州化学试剂厂产品；实验用水为二次蒸馏水。

士的宁、毛果云香碱、阿托品、西伐丁、那可丁：购于中国药品生物制品检定所；山梗菜碱、毒扁豆碱：美国Sigma公司产品；东莨菪碱、麻黄碱：天津一方科技有限公司产品。各生物碱纯度均大于98%。

实际样品：客户送检的植物草本化妆品，取样前混合均匀。

1.2 标准溶液的配制

准确称取9种生物碱标准品，用甲醇溶解，配制成100 mg/L的单标准储备液，置于棕色瓶中，于-20 ℃保存。根据需要吸取适量的标准储备液，用阴性空白基质提取液稀释定容，得到0.2、0.5、1、2、10、25、50和100 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1水基质类化妆品 称取1 g(精确至0.001 g) 样品于25 mL具塞比色管中，加入2 mL水，用氨水-甲醇溶液(2∶98，V/V)定容至10 mL，涡旋振荡30 s，使样品混合均匀，超声提取10 min，过0.22 μm有机系滤膜后，待测。

1.3.2乳液膏霜基质类化妆品 称取1 g(精确至0.001 g)样品于25 mL具塞比色管中，加入1 mL水涡旋，使样品分散，再加入1 mL正己烷，用氨水-甲醇溶液(2∶98，V/V)定容至10 mL，涡旋振荡30 s，使样品混合均匀，超声提取10 min混合均匀试样，转移到25 mL离心管中，将离心管置于4 ℃冰箱中1 h，取出后以4 000 r/min离心10 min，弃去上层正己烷，取下层清液过 0.22 μm 有机系滤膜后，待测。

1.4 实验条件

1.4.1色谱条件 色谱柱：Poroshell 120 Bonus-RP(3.0 mm×100 mm×3 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A为0.2%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.4 mL/min；进样量：2 μL；梯度洗脱程序：0～1.5 min(98%A)，1.5～2.0 min(98%～90%A)，2.0～5.0 min(90%～85%A)，5.0～8.0 min(85%～75%A)，8.0～10.0 min(75%～40%A)，10.0～12.0 min(40%～20%A)，12.0～12.1 min(20%～5%A)，12.1～13.0 min(5%A)，13.0～13.1 min(5%～98%A)。

1.4.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描方式；多反应监测(MRM)模式；雾化气压力：2.76×105Pa；干燥气流速：6 L/min；干燥气温度：300 ℃；毛细管电压：4 000 V。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

化妆品成分复杂，化学原料种类多(如甘油、十八烷酸和阳离子表面活性剂等)，这些原料会对色谱分离和检测过程产生干扰。因此，化妆品的提取和纯化是实验的关键。不同类型的化妆品因基质不同应选用不同的前处理方法，本文主要讨论基质较复杂的乳液膏霜类化妆品。

2.1.1提取方法的优化 选择甲醇、乙醇、乙腈3种常用的生物碱提取溶剂提取样品，结果表明，采用甲醇和乙腈提取的样品回收率较高。生物碱呈碱性，在碱性环境中容易游离出来，易溶于有机溶剂。因此，在甲醇和乙腈中分别添加不同含量的氨水，考察提取效果。结果表明，2%氨水-甲醇溶液作为提取溶剂的提取回收率最优。

常用的除脂溶剂为石油醚和正己烷，通过实验发现，正己烷的除脂效果较好，示于图1。理论上，应该在样品提取后进行除脂，实验中发现，在提取过程中同时加入1 mL正己烷也可以达到很好的除脂效果，并且不会对回收率产生影响，将提取与净化同时进行，简化了操作流程。乳液膏霜类化妆品一般包含脂溶型和水溶型。实验发现，对于一些水溶型样品，仅使用2%氨水-甲醇溶液作为提取剂，涡旋时有絮状物出现，提取效果不好。为了兼顾不同类型，在提取过程中加入1 mL水分散样品，使水溶型样品可以得到充分提取。

注：A.士的宁；B.毛果云香碱；C.西伐丁；D.那可丁；E.山梗菜碱；F.阿托品；G.东莨菪碱；H.麻黄碱；I.毒扁豆碱图1 9种生物碱在石油醚和正己烷中的回收率Fig.1 Recoveries of 9 alkaloids in petroleum ether and hexane

2.1.2超声水浴时间的影响 乳液膏霜类化妆品的黏度较大，本实验将涡旋振荡与超声水浴结合提取化妆品中生物碱。首先通过涡旋振荡使样品充分分散，再利用超声水浴提取的空化效应使样品分散均匀，使之与提取溶剂接触更充分。本实验考察了5、10、15、20、25 min超声时间对化妆品中9种生物碱提取效率的影响。结果表明，生物碱的回收率随超声时间的延长而增大，10 min之后的回收率增长不明显，为节约时间，选择超声时间10 min。另外，在提取过程中将样品溶液置于4 ℃冰箱中冷藏1 h，可以减少油脂的抽提量[26]，有利于后续的实验操作。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1色谱柱的选择 Poroshell 120系列色谱柱由单步多孔壳层工艺制造而成，分离效率高，可以减少色谱柱批次之间的细微差异。本实验考察了Poroshell 120的三款色谱柱SB-C18(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)、Bonus-RP(3.0 mm×100 mm×3 μm)和HPH-C18(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)的分离效果。结果表明，使用SB-C18色谱柱，西伐丁/山梗菜碱、士的宁/阿托品没有达到基线分离；使用HPH-C18色谱柱，9种生物碱基本上实现了基线分离，但是峰形较差；使用Bonus-RP色谱柱，峰形较好，对阿托品和毒扁豆碱没有选择性分离，但由于这2种生物碱的分子质量差异较大，可以通过质谱区分，示于图2。因此，选择Bonus-RP色谱柱。此外，在Bonus-RP和HPH-C18色谱柱中，山梗菜碱都出现了2个色谱峰，二者的一级质谱和二级质谱基本一致，初步判断是一对同分异构体，山梗菜碱结构中的酮基氮杂环己烷构型不稳定，在亲水性溶剂或有羟基存在时，通过逆迈克尔加成生成同分异构体，即顺式山梗菜碱会转化为反式山梗菜碱，并最终达成平衡[27]。

注：1.毛果云香碱;2.麻黄碱;3.东莨菪碱;4.毒扁豆碱;5.阿托品;6.士的宁;7.那可丁;8.山梗菜碱;9.西伐丁图2 9种生物碱的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of 9 alkaloids

2.2.2流动相的选择 由于选择电喷雾正离子模式(ESI+)采集质谱数据，故在流动相中加入酸性介质，有利于被测组分离子化，提高质谱响应和检测灵敏度。在Bonus-RP色谱柱下，考察了0.2%甲酸水溶液-乙腈(或甲醇)，0.2%乙酸水溶液-乙腈(或甲醇)，以及0.2%甲酸水溶液(含10 mmol/L甲酸铵)-乙腈5种常用的流动相体系对目标物分离效果的影响。结果发现，在甲醇存在的体系下，9种生物碱不能得到很好的分离，而在0.2%甲酸水溶液(含10 mmol的甲酸铵)和0.2%乙酸水溶液-乙腈体系中，目标物的响应明显降低。因此，选择0.2%甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相。9种生物碱的定量离子色谱图示于图3。

2.2.3流速的选择 本实验考察了不同流速对目标物的分离效果。结果发现，当流速较小时，峰形不好；当流速较大时，对毛果云香碱的保留变弱，出峰时间变早。综上所述，选择0.4 mL/min的流速。

注：a.士的宁；b.毛果云香碱；c.西伐丁；d.那可丁；e.山梗菜碱；f.阿托品；g.东莨菪碱；h.麻黄碱；i.毒扁豆碱图3 9种生物碱的定量离子对MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of quantitative ion pair of 9 alkaloids

2.2.4柱温的选择 本实验考察了20、25、30、35 ℃等柱温条件对化合物色谱分离的影响。结果表明，当柱温为30 ℃时，9种生物碱的响应最佳，保留值和色谱峰形最理想。

2.3 质谱条件的优化

在电喷雾离子源正、负离子模式下，对1 mg/L各待测物单标准溶液进行一级全扫描分析，获得准分子离子。9种生物碱在正离子模式下的响应最高，主要原因是生物碱属于含氮原子的杂环化合物，氮原子上存在的孤电子对容易加合氢离子，因此得到待测物的基峰离子均为[M+H]+。在正离子模式下对碎裂电压和碰撞能量进行优化，为了满足欧盟 EC/657/2002关于4个确证点的要求，以响应值最大的碎片离子为定量离子，次级响应的碎片离子为定性离子，优化后的质谱参数列于表1。

2.4 生物碱的质谱碎裂机理

生物碱的碎裂有以下特点：共轭环上的N不易发生碎裂，非共轭或不在环上的N则容易发生碎裂，如士的宁；部分莨菪烷类生物碱阿托品、东莨菪碱，由于在四氢吡咯环上没有含氧基团，因此较稳定，而酯基的组分则易发生氢转移，酯键断裂；四氢吡咯吲哚生物碱主要先失去部分侧链，其次是四氢吡咯环的裂解，如毒扁豆碱；当结构中含有内酯时，则易开环产生中性碎片CO2或HCOOH丢失，如毛果云香碱；含羟基组分易以H2O的形式产生中性碎片丢失，产生双键形成共轭结构，在结构上达到局部稳定，如麻黄碱、西伐丁和山梗菜碱中H2O的丢失；那可丁的特征碎片以失去甲基或甲氧基为主要裂解方式。9种生物碱的裂解途径示于图4。

表1 9种生物碱的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 9 alkaloids

2.5 方法评价

2.5.1基质效应 化妆品基质较复杂，可能干扰目标物的离子化效果，从而影响质谱响应。一般直接采用HPLC-MS/MS法进行分析时会有较强的基质效应[6,28]。本研究考察了3种乳液膏霜的基质效应，取阴性化妆品样品，按1.3.2节方法处理后，加入一定量的标准储备液，配制成1 μg/kg的基质标准溶液进样分析，同时将1 μg/kg的标准溶液直接进样分析。

(1)

式中，Mi为基质溶液中生物碱的基质效应；Ami为空白基质溶液中待测物的色谱峰面积；Asi为纯溶剂中相应待测物的色谱峰面积。|Mi|<20%为弱基质效应；20%≤|Mi|≤50%为中等程度基质效应；|Mi|>50%为强基质效应。当基质效应在中等程度以上，影响定量结果时就需要对基质效应进行校正[29]。本实验通过式(1)计算出3种不同乳液膏霜Mi的大致范围在22%～43%之间，为中等程度基质抑制效应，示于图5。采用空白乳液膏霜基质提取液配制标准工作液，称取适量空白样品，按1.3.2节方法进行前处理，制备空白基质溶液。用空白基质溶液将标准储备液逐级稀释得到系列标准工作溶液，使标准工作溶液和样品溶液具有相似的离子化环境，确保方法定性与定量分析的准确性。

注：a.士的宁；b.毛果云香碱；c.西伐丁；d.那可丁；e.山梗菜碱；f.阿托品；g.东莨菪碱；h.麻黄碱；i.毒扁豆碱图4 9种生物碱的裂解机理Fig.4 Fragmentation mechanisms of 9 alkaloids

2.5.2线性关系、检出限和定量限 在最优的实验条件下，分别测定9种生物碱质量浓度为0.20～600 μg/L的系列混合标准工作液。以混合标准工作液的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，以各生物碱的定量离子对色谱峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，获得线性回归方程，相关系数为0.993 4～0. 999 8，表明待测物在各自的线性范围内呈良好的线性关系。以信噪比S/N≥3和S/N≥10确定检出限(LODs)和定量限(LOQs)，分别为0.03～0.36 μg/kg和0.1～1.2 μg/kg，结果列于表2。

2.5.3回收率和精密度 在最优的实验条件下，选取4种基质较复杂的乳液膏霜类阴性样品进行加标回收实验。每种基质分别添加0.20、2.0 和 25 μg/kg 3个浓度水平的分析物混合标准工作液，按1.3.2节方法进行处理，每个浓度平行测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)，列于表3。结果表明，3种加标浓度的平均回收率为85.3%～135.3%，RSD为1.0%～13.4%，能够满足日常化妆品中9种生物碱的检测要求。

2.6 实际样品检测

应用本方法检测抽取的2份水剂和8份乳液膏霜类草本型化妆品中的生物碱，均未检出，加标回收率在75.6%～117%之间，符合质控要求。

注：1.士的宁;2.毛果云香碱;3.西伐丁;4.那可丁;5.山梗菜碱;6.阿托品;7.东莨菪碱;8.麻黄碱;9.毒扁豆碱图5 3种乳液膏霜基质中9种生物碱的基质效应Fig.5 Matrix effect of nine alkaloids in three cream bases

表2 9种生物碱的线性方程、相关系数、定量限、检出限、线性范围Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and linear ranges of 9 alkaloids

表3 9种生物碱的加标回收率及相对标准偏差Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 9 alkaloids

续表3

3 结论

本研究建立了HPLC-MS/MS法同时测定化妆品中9种禁用生物碱，样品前处理过程中将除脂与净化同步进行，简化了操作流程，同时探讨了生物碱的质谱碎裂机理。该方法前处理简便、高效，灵敏度可达0.03～0.36 μg/kg，回收率和精密度均能满足化妆品中生物碱的检测要求，可用于化妆品中禁用生物碱的监测。