基于HPLC-MS/MS快速筛选阿卡波糖及其类似物的菌株

赖晓红，李 敏，周 燕，夏 兵

(中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041)

糖尿病是一种代谢性疾病，同肿瘤、心血管疾病成为威胁人类健康的三大疾病。我国是糖尿病上升率最快的国家，目前是糖尿病患病第二大国。糖尿病已被国家列为“新药创制科技重大专项”的十大类疾病之一，降糖药物的研究日益重要。α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过可逆性地抑制小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的α-葡萄糖苷酶对二糖或寡糖1→4糖苷键的水解作用，从而达到降低餐后血糖水平的效果[1]。临床上应用α-葡萄糖苷酶抑制剂的代表性药物主要有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇和乙格列脂[2]，其中以阿卡波糖的应用最为广泛[3]。

阿卡波糖是游动放线菌产生的一种具有α-葡萄糖苷竞争性抑制作用的次级代谢产物，其结构是C7N-氨基环醇类的假性四糖物质[4]。Mahmud[5]指出，具有C7N-氨基环醇结构的大多数化合物均显示出有效的α-葡萄糖苷酶抑制作用，如阿卡波糖、脂肪族素、支链淀粉抑素、低聚他汀。其中，氨基环醇和4-氨基-4,6-二脱氧葡萄糖组成的二单元是其显示活性的核心结构[6]。因此，具有相同核心结构的阿卡波糖类似物大多数也具有α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用[7]。阿卡波糖的结构复杂，人工合成较为困难、成本较高、收率较低，主要依靠生物发酵法获取阿卡波糖[8]。

目前，国内微生物发酵法生产阿卡波糖的发酵水平较低、成本高、规模小，如果有高效的方法筛选高产量的阿卡波糖产生菌，则会大大降低阿卡波糖的生产成本。目前报道的筛选阿卡波糖发酵液的方法主要有薄层层析法(TLC)[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10]和基于α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的筛选方法[11-13]，如吡喃葡萄糖苷比色(PNPG)法[14]。未见基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法从阿卡波糖发酵液中筛选阿卡波糖菌株的报道。本文拟通过优化串联质谱条件，建立HPLC-MS/MS法筛选阿卡波糖产生菌，希望为推动阿卡波糖的工业化生产提供实验方案。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC/Xevo TQ超高效液相色谱-质谱仪：美国Waters公司产品；甲醇(HPLC级)：美国Fisher Scientific公司产品；超纯水：由PCWJ-10超纯水机制得；WCX型阳离子型交换固相萃取柱：纳谱分析技术有限公司产品；阿卡波糖对照品：成都携进生物科技有限公司产品；阿卡波糖杂质A、阿卡波糖杂质D：实验室自制，纯度大于98%。

1.2 实验条件

1.2.1色谱条件 Waters CORTECS UPLC C18+色谱柱(2.1 mm×100 mm×1.6 μm)；流动相：水(A)和甲醇(B)；梯度洗脱条件：0～2 min(5%B)，2～12 min(5%～95%B)，12～17 min(95%B)，17～18 min(95%～5%B)，18～20 min(5%B)；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL；检测波长210 nm。

1.2.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式，多反应监测(MRM)扫描，毛细管电压2.5 kV，锥孔电压30 V，离子源温度150 ℃，锥孔气(氮气)流速50 L/h，脱溶剂气流速500 L/h，脱溶剂气温度550 ℃。

1.3 阿卡波糖菌株的培育

分别取位于成都沙河大桥旁的河边、菜地、番茄地中适量的土壤，共采集20 g样品。将采集的土壤翻晒自然干燥7天，称取1 g干燥后的土壤，加入100 mL生理盐水中，分别在40、50、60、70、80 ℃下水浴加热20 min[9]，不加热的土壤样品作为空白对照，用无菌生理盐水将样品稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6个浓度，接种高氏培养基培育7天，以10%接种量接种至发酵培养基，于28 ℃恒温振荡培养箱，以200 r/min摇瓶培养7天，得实验用阿卡波糖发酵液[15]。

1.4 溶液配制

1.4.1对照溶液的配制 分别精密称取适量的阿卡波糖、阿卡波糖杂质A、阿卡波糖杂质D对照品，加入甲醇超声溶解后，再加入20 μL 0.1 g/L NaCl水溶液，于12 000 r/min离心7 min，取上层液体，即得对照品溶液。

1.4.2供试品溶液的配制 分别使用乙腈、超纯水淋洗阳离子型固相萃取小柱，加入1～2 mL发酵液原样，过滤得滤液，将处理过的发酵液稀释约30倍(即取30 μL发酵液加超纯水稀释至1 mL)，于12 000 r/min离心7 min，取上层清液，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2 结果与讨论

2.1 阿卡波糖及其类似物的质谱裂解

2.1.1正负离子模式的选择 本实验进行了阿卡波糖、阿卡波糖杂质A、阿卡波糖杂质D的质谱分析，结果表明，阿卡波糖在正离子模式下产生的碎片离子及其强度优于负离子模式，故采用正离子模式。

2.1.2特征离子碎片 阿卡波糖及其类似物的母离子[M+H]+在一定的碰撞能量下均会产生m/z304.1特征碎片。阿卡波糖及其杂质A、D的二级质谱图示于图1。

2.1.3质谱裂解规律 正离子模式下，阿卡波糖对照品的准分子离子峰为m/z646.3，给予其30 eV的能量碰撞诱导解离，主要裂解途径为优先失去1个麦芽糖产生碎片离子m/z304.1，进一步碎裂再失去1个不饱和环醇，产生碎片离子m/z146.1。阿卡波糖杂质A比阿卡波糖更容易丢失1分子H2O生成碎片离子m/z628.2，阿卡波糖丢失末端1个糖单元，产生碎片离子m/z466.2，若碎片离子m/z304.1进一步丢失1分子H2O，则产生碎片离子m/z286.1。阿卡波糖杂质A和杂质D具有与阿卡波糖相同的C7N单元和相似的裂解途径，示于图2。

2.2 阿卡波糖及其类似物的筛选方法

超高效液相色谱以甲醇和水为流动相，样品经梯度洗脱后进入质谱分析。以阿卡波糖及其类似物的对照品二级质谱图为依据，在正离子模式下扫描分析物。阿卡波糖类似物具有相同的C7N单元，有报道[5]证明，具有相同的C7N单元都能产生m/z304.1子离子碎片。因此，可以利用这一质谱特征对阿卡波糖及其类似物进行筛查。

由于未进行针对性的发酵条件优化，发酵液中阿卡波糖及其类似物的浓度较低，代谢产物复杂，为了提高检测灵敏度，采用灵敏度较高的MRM扫描模式。以阿卡波糖及其类似物的准分子离子为母离子，以其共有的m/z304.1为子离子，在MRM模式下对阿卡波糖及其类似物进行扫描，观察是否检测到对应化合物的峰，以此判断发酵液中是否存在相应化合物。阿卡波糖及其类似物的母离子及特征碎片离子列于表1。阿卡波糖对照品的UPLC-MS总离子流图示于图3，保留时间为4.5 min。

2.3 阿卡波糖菌株的筛选

以m/z646.3为母离子，m/z304.1为子离子的MRM扫描模式分析阿卡波糖发酵液，通过对比保留时间鉴定发酵液中是否含有阿卡波糖及其类似物。本实验筛选了来自于河边、菜地和番茄地土壤的20种发酵液。在编号为AB/F-01样品中，MRM扫描模式下总离子流图的相应保留时间处有疑似阿卡波糖或阿卡波糖杂质A的谱峰(化合物1)。在阿卡波糖杂质的筛选中，编号为HE2-1C的发酵液中筛选到疑似阿卡波糖杂质D的谱峰(化合物2)，保留时间为1.8 min，强度较小。AB/F-01和HE2-1C发酵液的总离子流图示于图4。

图1 阿卡波糖(a)、阿卡波糖杂质A(b)、阿卡波糖杂质D(c)的二级质谱图Fig.1 MS/MS spectra of acarbose (a), acarbose impurity A (b) and acarbose impurity D (c)

图2 正离子模式下，阿卡波糖、阿卡波糖杂质A和杂质D的裂解途径Fig.2 Fragmentation pathways of acarbose, acarbose impurity A, acarbose impurity D at positive ion mode

表1 阿卡波糖及其类似物的母离子及特征碎片离子Table 1 Parent ions and characteristic product ions of acarbose and its analogs

图3 MRM扫描模式下，阿卡波糖对照品的总离子流图Fig.3 TIC of acarbose by MRM scanning at positive ion mode

2.4 阿卡波糖产生菌的确认

阿卡波糖对照品和阿卡波糖杂质A互为同分异构体，普通C18反相色谱柱在该条件下无法实现两者的分离，故本实验进行了串联质谱分析，以确证目标化合物1。在正离子模式下，其他质谱参数与1.2.2节保持一致，分别对阿卡波糖对照品和样品进行子离子扫描，以碰撞能量为横坐标，碎片离子相对丰度为纵坐标，绘制能量-丰度曲线图。结果表明，以[M+H]+为母离子进行二级质谱分析，两者的能量曲线极为相似(见附图S55～S56，请登录《质谱学报》网站http:∥www.jcmss.com.cn下载)，故选取[M+Na]+作为母离子。在38、40、42、44、46、48、50 eV 7个梯度的碰撞能量下，检测阿卡波糖和阿卡波糖杂质A的特征碎片离子m/z608.2、347.1、305.1、254.1的丰度，其能量-丰度曲线示于图5。阿卡波糖与阿卡波糖杂质A在结构上的主要区别是胺基环醇末端糖单元的羟基和氧原子的位置，两者在以[M+Na]+为母离子时，碎片离子存在较大差异。阿卡波糖对照品产生较大丰度的m/z608.2和m/z305.1，并且在44 eV时，m/z608.2相对丰度开始减小；阿卡波糖杂质A对照品m/z608.2和m/z305.1的整体丰度较低，变化趋势较小，同时能产生特有的碎片离子m/z347.1，并且变化趋势较大。

将发酵液样品浓缩后，以[M+Na]+为母离子进行二级质谱分析，选取m/z608.2、347.1、305.1、254.1绘制能量-丰度曲线，示于图6。通过与阿卡波糖及阿卡波糖杂质A对照品的能量曲线对比，发现其与阿卡波糖的能量曲线极为相似，因此判断样品中化合物1为阿卡波糖。样品中化合物2的含量较低，不足以进行串联质谱分析，不能确定其是否一定是阿卡波糖杂质D，有待培育出具有更高产率的阿卡波糖菌株进行验证。

图4 MRM扫描模式下，AB/F-01(a)和HE2-1C(b)发酵液的总离子流图Fig.4 TIC of fermentation broth of AB/F-01 (a) and HE2-1C (b) by MRM scanning at positive ion mode

图5 阿卡波糖(a)和阿卡波糖杂质A(b)的能量-丰度曲线图Fig.5 Energy-abundance curves of acarbose (a) and acarbose impurity A (b)

图6 AB/F-01发酵液中化合物1的能量-丰度曲线图Fig.6 Energy-abundance curves of compound 1 of AB/F-01

3 结论

本研究建立了HPLC-MS/MS法筛选不同来源阿卡波糖产生菌的发酵液，根据阿卡波糖及其类似物的特征质谱峰，结合其特有的二级离子碎片峰，归纳总结质谱裂解规律。实验表明，子离子扫描能够确定化合物的裂解途径，提供化合物的能量曲线，超高效液相色谱-串联质谱系统的MRM扫描模式能定性鉴别化合物，两者的结合使用能够快速、高效、便捷地筛选不同来源发酵液中的阿卡波糖，并可以应用于阿卡波糖类似物的筛选。通过子离子峰可判断子离子碎片中是否含有氮原子，进而可粗略判断该子离子和相应化合物中是否有C7N单元。本研究为α-葡萄糖苷抑制剂新化合物的发现提供了实验思路，有利于α-葡萄糖苷抑制类降糖药的开发。