脂肪醇氧化酶基因缺失对热带假丝酵母生理功能的影响

张海冰，张利华，陈献忠，沈 微，樊 游

(江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

热带假丝酵母是一种具有工业价值的非常规二倍体酵母，可以利用烷烃、脂肪酸等非常规物质为唯一碳源进行生长[1-2]。目前，人们主要利用热带假丝酵母合成长链二元酸并实现了工业规模化的生产[3-5]。当热带假丝酵母以烷烃为底物时，烷烃进入细胞后首先在微粒体中被细胞色素P450(CYP)与NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)共同催化，进行α-氧化，进而生成脂肪醇；随后，脂肪醇被转运至细胞质中，然后在脂肪醇氧化酶(FAO)或脂肪醇脱氢酶(ADH)、脂肪醛脱氢酶(FALDH)的催化作用下依次氧化成脂肪醛、脂肪酸。极少量的一元脂肪酸被分泌到细胞外，大部分的一元脂肪酸会再次转运至微粒体中，在相同的酶系催化作用下进行ω-氧化，最终生成α,ω-二羧酸[6-7]。

目前，针对ω-氧化途径相关的酶基因已经有了一些研究。Craft等[8]从热带假丝酵母中克隆并鉴定10个CYP基因，并且发现不同的CYP存在底物特异性，可作为改造ω-氧化途径的潜在靶点。Dickinson等[9]鉴定FAO为膜结合型黄素蛋白，并且对光敏感，以十二醇为底物进行动力学研究发现FAO催化反应符合乒乓机制。Eirich等[10]从热带假丝酵母ATCC 20336克隆了4个FAO基因，分别为2个FAO1、FAO2a和FAO2b，并将其在大肠杆菌进行外源表达，进一步研究发现FAO1只负责ω位碳原子氧化，而不能氧化β位碳原子，FAO2a和FAO2b的作用与FAO1相反。Cheng等[11]以热带假丝酵母ATCC 750为出发菌株，构建了FAOT等位基因双缺失的菌株，无法检测到FAOT酶活，并且细胞代谢烷烃受到很大影响。Lu等[12]累加敲除了4个FAO基因和其他12个相关基因，成功构建了利用肉豆蔻酸甲酯为底物发酵生产ω-羟基脂肪酸的菌株。王泽政等[13]从热带假丝酵母中鉴定脂肪醛脱氢酶基因并将其在大肠杆菌中异源表达，研究了相应的酶学性质，在此基础上敲除了2对CtAld基因后发现，突变株合成长链二元酸的能力显著下降。然而，FAO基因对热带假丝酵母细胞的碳源利用、细胞生长和代谢产物积累等生理功能影响还未见研究报道。

图1 烷烃在热带假丝酵母中代谢途径Fig.1 Metabolic pathway of alkanes in C. tropicalis

本研究中，笔者通过对热带假丝酵母ATCC 20336菌株的FAO基因进行敲除及回补，构建了3株基因突变菌株和2株基因回补菌株，分析了不同菌株在不同碳源中的生长情况及胞内酶活变化，并将突变菌株以烷烃为底物进行发酵，考察了突变株转化烷烃合成脂肪醇的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物

实验所用菌株见表1，U-204是由热带假丝酵母ATCC 20336使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建；质粒Tm-gda324-URA3、Ts-CAT1-gda324-URA3和Ts-CAT2-gda324-URA3均由笔者所在实验室保藏；pMD19-T Simple载体，TaKaRa公司；PCR引物，苏州泓迅生物科技股份有限公司合成(表2)。

表1 本研究所用菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 主要试剂与仪器

正十二烷醇(色谱级)、正十四烷醇(色谱级)、正己烷(色谱级)、正十二烷、正十三烷、正十四烷，阿拉丁试剂公司；酵母氮基(YNB)、5-氟乳清酸(5-FOA)，生工生物工程(上海)股份有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ATBS)，Sigma公司；一步克隆试剂盒(ClonExpress®II One Step Cloning Kit)，南京诺唯赞生物科技有限公司。

UV-2100型可见分光光度计，上海尤尼科有限公司；PCR扩增仪，上海东胜兴业科学仪器有限公司；ISQ单四级杆气质联用仪、高速台式离心机，赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.3 主要培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0。

MM培养基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0。

SM培养基(g/L)：YNB 6.7、葡萄糖20.0、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06。

5-氟乳清酸(5-FOA)培养基：在SM培养基的基础上添加2 g/L 5-FOA。

C+培养基(g/L)：YNB 6.7、(NH4)2SO410.0、尿嘧啶0.06；根据需要加入2%(体积分数)正十二烷、正十三烷或正十四烷。

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母粉10.0、蛋白胨20.0。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20.0、YNB 6.7、酵母粉6.0、蛋白胨3.0、K2HPO47.2、KH2PO49.3；若配制固体培养基,则再加入20.0 g/L琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 敲除盒构建

对热带假丝酵母ATCC 20336基因组进行分析，获得2对FAO等位基因，分别为FAO1(FAO11和FAO12)、FAO2(FAO2a和FAO2b)基因，根据基因序列构建敲除盒。以基因FAO11敲除盒构建为例，设计引物FAO11-F和FAO11-R，以热带假丝酵母ATCC 20336基因组为模板，PCR扩增FAO11基因，经PCR试剂盒纯化后，与pMD19-T Simple 载体进行连接，获得重组质粒Ts-FAO11；以质粒Ts-FAO11为模板，设计引物rFAO11-F和rFAO11-R(分别添加PstⅠ 和XbaⅠ 酶切位点)，反向PCR得到片段FAO11U-Ts-FAO11D，凝胶回收该片段，将该片段与质粒Tm-gda324-URA3同时经限制性内切酶PstⅠ和XbaⅠ 消化，再凝胶回收后将片段FAO11U-Ts-FAO11D与片段gda324-URA3连接，获得重组质粒Ts-FAO11-gda324-URA3。以上述重组质粒为模板，用引物FAO11-F和FAO11-R，PCR得到敲除盒FAO11U-gda324-URA3-FAO11D(图2)。利用相似策略，构建其他基因敲除盒，所用引物见表2。

图2 重组质粒Ts-FAO11-gda324-URA3构建过程Fig.2 Construction of FAO11 disruption plasmid Ts-FAO11-gda324-URA3

1.2.2 脂肪醇氧化酶基因敲除过程

将敲除盒转入热带假丝酵母采用LiCl转化法[14]。以尿嘧啶缺陷型菌株U-204为出发菌株，以URA3基因为筛选标记，将敲除盒转入宿主内，接着涂布到MM固体培养基挑取转化子，提取基因组，PCR验证鉴定出正确转化子；将上步正确的转化子涂布到5-FOA培养基，再次挑选转化子，提取基因组，PCR初步验证弹出URA3基因后，将PCR产物送至公司测序，序列比对无误后保藏正确菌株；此方法可以重复利用筛选标记[15-16]。以FAO1基因敲除过程为例,具体敲除过程见图3。

图3 热带假丝酵母FAO1基因敲除流程Fig.3 Sequential gene disruption of FAO1 in C. tropicalis

1.2.3 脂肪醇氧化酶基因回补实验

以FAO11基因表达为例描述具体的实验过程。以热带假丝酵母ATCC 20336基因组为模板，使用引物SFAO11-F和SFAO11-R进行PCR扩增，得到FAO11基因的启动子、结构基因和终止子，验证正确并纯化后，通过一步克隆法将线性化的质粒Ts-CAT1-gda324-URA3、FAO11基因启动子、结构基因和终止子连接起来，得到重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11。重组质粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a与上述构建步骤一致。使用引物CAT1-F和CAT1-R或引物CAT2-F和CAT2-R，以相应的质粒为模板进行PCR扩增，产物纯化后构建质粒后导入酵母转化，两者的转化宿主分别为FTYT和2aT2bT菌株。

1.2.4 酵母细胞在不同碳源的生长情况

将各菌株在平板上划线培养，挑取单菌落转接到SM培养基，取适量菌液转接到C+培养基中，初始OD600控制在0.10～0.15，每株菌3个生物学平行，每隔8 h或12 h测量一次OD600，84 h时测量结束并绘制生长曲线。

1.2.5 脂肪醇氧化酶酶活测定

酶活测定方法在文献[10]的基础上有所改动。将单菌落在SM培养基培养2 d后转接入新鲜SM培养基，加入2%(体积分数)十二烷培养2 d后取20 mL菌液离心收集菌体，用50 mmol/L HEPES缓冲液洗涤2次后将菌体在ST缓冲液(细胞壁水解酶lyticase 缓冲液)中重新悬浮，并添加酵母细胞壁水解酶至60 U/mL，于30 ℃金属浴1 h，每隔20 min上下倒置混匀1次。5 000 r/min离心10 min收集原生质体，用K3PO4缓冲液洗涤2次，最后重悬在5 mL K3PO4-甘油缓冲液中，使用超声波破碎仪对细胞进行破碎，总时长30 min，然后将细胞破碎液在4 ℃下37 000 r/min离心30 min，取上清液在4 ℃、100 000 r/min条件下离心1 h收集微粒体后，加入适量K3PO4-甘油缓冲液溶解微粒体后在-20 ℃下保藏，溶解液用作粗酶液，用Bradford法(考马斯亮蓝法)测定粗酶液中的总蛋白含量。

最终的反应混合物由500 μL的200 mmol/L HEPES缓冲液、50 μL的10 mg/mL ATBS溶液、10 μL的5 mmol/L十二烷醇溶液和5 μL的HRP溶液组成。不同量的细胞提取物加入反应体系，补加去离子水至1 mL。脂肪醇氧化酶酶活测定在分光光度计405 nm处，在室温下进行测量。1个酶活单位(U)定义为1 min氧化1 μmol底物所需的酶量。对以1 mmol/L ABTS+·在405 nm处的消光系数为18.4折算，相当于0.5 mmol/L氧化底物。

1.2.6 摇瓶发酵实验

将菌株U-204、FTYT、2aT2bT和F3YT在平板上划线培养，挑取单菌落转接到SM培养基，200 r/min、30 ℃培养2 d后，再以1%(体积分数)接种量转接到SM液体培养基，同时加入2%(体积分数)正十二烷培养2 d后，以10%接种量转接到发酵培养基中，同时加入2%正十二烷200 r/min、30 ℃培养，每株菌3个生物学平行。发酵开始后，0～48 h用2 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4调pH至5.5～6.0；48 h后每隔12 h调pH至7.5～8.0，每隔24 h补加2.5%(体积分数)甘油(50%)，培养72 h时补加2%正十二烷，发酵周期为160 h。

1.2.7 发酵产物中脂肪醇的检测

标准品配制。准确称取正十二烷醇和正十四烷醇各30 mg，将两者溶解于色谱级正己烷中，配制成终质量浓度为30 mg/L的标准品。

M为标准DNA。图4(a):1～4—质粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3双酶切的结果。图4(b):1～4—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO11-gda324 -URA3为模板，FAO11-F和FAO11-R为引物的PCR结果;5～8—以FTYT`URA3+、FTYT`URA3-、U-204和Ts-FAO12-gda324-URA3为模板，FAO12-F和FAO12-R为引物的PCR结果。图4(c):1～4—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2a-gda324-URA3为模板，FAO2a-F和FAO2a-R为引物的PCR结果； 5～8—以2aT2bT `URA3+、2aT2bT `URA3-、U-204和Ts-FAO2b-gda324-URA3为模板，FAO2b-F和FAO2b-R为引物的PCR结果图4 脂肪醇氧化酶基因敲除菌株的构建Fig.4 Disruption of the FAO1 or FAO2 genes disruption in C. tropicalis

发酵液处理方法。取5 mL发酵液于离心管中，同时加入正十四烷醇作为内标，煮沸加热15 min用来破碎细胞，随后加入10 mL色谱级正己烷涡旋振荡15 min萃取目的产物，12 000 r/min离心5 min，取上层液体1 mL于2 mL进样瓶中，最后通过气质联用仪检测发酵产物[18-19]。

气质联用检测方法。①色谱条件为TG-WAXMS气相色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为He，流速为1 mL/min,升温程序：50 ℃保持1 min后，以10 ℃/min速度上升至230 ℃，保持15 min。②质谱条件为传输线温度230 ℃，离子源温度260 ℃，EI离子源，电子能量70 eV，扫描方式采用EI全扫描。

2 结果与讨论

2.1 脂肪醇氧化酶基因突变株的构建

构建FAO1和FAO2基因敲除盒质粒，用限制性内切酶PstⅠ和XbaⅠ双酶切分别验证质粒Ts-FAO11-gda324-URA3、Ts-FAO12-gda324-URA3、Ts-FAO2a-gda324-URA3和Ts-FAO2b-gda324-URA3结果见图4(a)。理论上预期片段大小依次为3 504和1 923 bp、3 226和1 923 bp、3 500和1 923 bp以及3 486 bp和1 923 bp的两条带。由图4(a)可知，PCR验证的条带上的1～4，与理论预期的大小一致，将它们再送至公司测序验证，表明4个FAO基因敲除质粒构建成功。

用上述重组质粒为模板，PCR扩增出相应的敲除盒，将其转入宿主中，挑取转化子，并提取基因组，使用对应同源臂上下游引物进行验证，结果见图4(b)～(c)。理论上应扩增出2 565、2 547、2 718和2 704 bp的条带。图4(b)和(c)的条带1和5的结果与理论预期值一致，表明敲除了FAO1基因和FAO2基因；将转化子弹出URA3基因后再依次用上述引物扩增，理论上应扩增出980、870、1 132和1 118 bp，图4(b)和(c)的条带2和6的结果与理论预期值一致；图4(b)和(c)的条带3与7是以相应的出发菌株为对照，4与8泳道是以相应的敲除质粒为对照。将图4(b)和(c)中相关泳道的PCR产物纯化后进行DNA测序，结果显示成功构建了菌株FTYT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324)、2aT2bT(ura3/ura3fao2a::gda324fao2b::gda324)和F3YT(ura3/ura3fao11::gda324/fao12::gda324fao2a::gda324fao2b::gda324)。

2.2 脂肪醇氧化酶基因的回补表达

将构建的重组质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11和Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a送至公司测序，验证正确无误后，用上述重组质粒为模板，PCR扩增出相应的表达盒，将其转入相应宿主中，挑取转化子，并提取基因组；使用对应的同源臂上下游引物进行验证，结果见图5。理论上应扩增出6 389和5 960 bp的条带。由图5可知，条带1和4对应的结果与理论预期值一致。条带2与5是以相应表达质粒为对照，条带3与5是以相应出发菌株为对照，由于整合位点是等位基因，因此1和4泳道会存在和3和6泳道对应的条带。将图5相关泳道的PCR产物送至公司进行测序，结果显示成功构建了UCF1和UCF2菌株。

M—标准DNA; 1～3—以菌株UCF1、FTYT和质粒Ts-CAT1-gda324-URA3-PFAO11-FAO11-TFAO11为模板， CAT1-F和CAT1-R为引物的PCR 结果; 4～6—以菌株UCF2、2aT2bT和质粒Ts-CAT2-gda324-URA3-PFAO2a-FAO2a-TFAO2a，CAT2-F和CAT2-R为引物的PCR 结果图5 脂肪醇氧化酶基因回补Fig.5 Complementation of fatty alcohol oxidase genes

2.3 突变株在不同碳源条件下的生长情况

考察各菌株在不同碳源条件下的生长情况，来分析FAO基因缺失对菌株利用碳源的影响，结果见图6。由图6可知：当以葡萄糖为唯一碳源时，各菌株生长情况并无明显差异；当以烷烃(C12～C14)为唯一碳源时，各菌株的延滞期变长，并且生长情况出现显著差异，敲除FAO1基因的FTYT菌株生长速度快于U-204菌株，而敲除FAO2a和FAO2b基因的2aT2bT突变株和组合敲除4个基因的F3YT菌株生长都受到明显抑制，且F3YT只表现出极微弱的生长；菌株UCF1(FTYT菌株回补FAO11基因)和UCF2(2aT2bT菌株回补FAO2a基因)回补基因后与出发菌株生长情况无显著差异。在烷烃培养基上，虽然FAO1基因敲除促进菌株生长，FAO2基因敲除抑制菌株生长，但是两个基因同时敲除菌株却几乎不生长，这也说明了FAO2基因在烷烃代谢过程中扮演着更为重要的角色。

图6 不同碳源的对菌株生长的影响Fig.6 Effects of carbon sources on strain growth

值得注意的是，当FAO1基因敲除后，突变株生长速度快于出发菌株，这是很有趣的结果。有研究表明，热带假丝酵母中细胞色素P450家族中的CYP52A17也可以直接氧化脂肪醇[20]，由此推测敲除FAO1导致ω氧化途径中其他酶解除抑制，从而加速烷烃的利用。总之，敲除FAO基因敲除会影响细胞利用烷烃，FAO1基因的敲除可促进细胞利用烷烃生长，FAO2基因的敲除却抑制细胞利用烷烃生长，这表明FAO1和FAO2基因的功能存在差异。

2.4 FAO基因缺失对菌株十二烷醇氧化酶酶活的影响

以正十二烷醇为底物检测脂肪醇氧化酶酶活，结果见图7。由图7可知：出发菌株的比酶活比各基因突变株明显要高，说明FAO1基因的缺失导致脂肪醇氧化酶的酶活显著下降，比U-204菌株下降近79%；FAO2基因缺失后的菌株脂肪醇氧化酶酶活性损失仅为U-204菌株的37.5%；组合敲除FAO1和FAO2基因后，菌株F3YT中的脂肪醇氧化酶比酶活比FTYT菌株的又一次降低，与U-204菌株相比降低近89%，这表明FAO1与FAO2之间存在差异，与不同菌株对碳源的利用结果一致。

图7 十二烷诱导各菌株的比酶活Fig.7 Dodecane induces specific enzymeactivity of each strain

2.5 FAO基因缺失对菌株积累脂肪醇的影响

发酵结束后，将标准样品和待测样品同时采用气质联用仪检测，结果见图8。由图8可知：正十二烷醇与正十四烷醇的保留时间相差2 min左右，两峰互不干扰，目标产物的离子峰与预期的一致，并且与标准离子峰比较，鉴定物质为正十二烷醇和正十四烷醇。

图8 气质联用分析发酵产物Fig.8 GC-MS analysis of products

通过计算得到各菌株积累的正十二烷醇含量，结果见图9。由图9可知：U-204菌株与2aT2bT菌株几乎不积累正十二烷醇，分别为0.13和0.21 mg/L；FTYT菌株和F3YT菌株积累不同含量的正十二烷醇，分别为9.73和59.63 mg/L；与出发菌株相比，单独敲除FAO1基因就可以积累少量正十二烷醇，单独敲除FAO2基因几乎不积累目标产物，同时敲除FAO1和FAO2基因导致正十二烷醇积累量显著提高，是FTYT菌株的6倍左右，是出发菌株的近460倍。

图9 FAO1和FAO2基因敲除对正十二烷醇积累的影响Fig.9 Effects of FAO1 and FAO2 genes disruption on 1-dodecanol production in C. tropicalis

当FAO2基因单独敲除后，几乎不积累目标产物，但在FAO1基因敲除的基础上在敲除FAO2基因，目标产物产量得到显著提升，这与前面研究的结果一致。脂肪醇到脂肪醛这一步的催化，还存在脂肪醇脱氢酶(ADH)负责脂肪醇的氧化，并且FAO与ADH基因在细胞内分布的位置不同，功能之间也存在差异[21-22]。目前微生物发酵法生产脂肪醇大多数是通过代谢工程改造大肠杆菌或酵母，以葡萄糖为底物合成脂肪醇[18,23]，而热带假丝酵母能够利用烷烃合成二元酸，脂肪醇氧化酶FAO是二元酸合成途径中催化脂肪醇到脂肪醛的关键酶，通过敲除脂肪醇氧化酶编码基因FAO理论上能够实现脂肪醇的积累，为脂肪醇的生产提供了一条新思路。本论文结果也证明了我们的推测，但脂肪醇的产量相对较低，依然有很大提升空间，可以在F3YT菌株的基础上过表达相关CYP与CPR酶基因，同时敲除有关ADH基因来提升脂肪醇含量。综上所述，FAO1基因和FAO2基因在细胞烷烃代谢中具有重要作用，基因缺失可导致菌株积累脂肪醇，可以将其作为代谢工程改造热带假丝酵母生产脂肪醇的潜在靶点。

3 结论

对热带假丝酵母ω-氧化途径中的FAO基因进行敲除及回补，成功构建了不同突变菌株；选择不同碳源考察缺失FAO基因后菌株的生长情况以及胞内相应酶活变化以及以烷烃为底物转化脂肪醇的能力，获得以下主要结论：

1)FAO基因在热带假丝酵母细胞烷烃代谢烷烃中具有重要作用，FAO1或FAO2基因缺失对细胞利用烷烃产生不同的影响，两者功能存在差异。

2)FAO基因缺失可导致热带假丝酵母积累脂肪醇，F3YT菌株可以积累正十二烷醇59.63 mg/L，是出发菌株的近460倍。FAO基因可作为改造热带假丝酵母生产脂肪醇的潜在靶点。