含瓜蒌方剂的组方规律及核心药对“瓜蒌-甘草”的作用机制：基于网络药理学和分子对接技术

鄢海燕，邹纯才

皖南医学院药学院，安徽 芜湖241002

瓜蒌为葫芦科植物栝楼（Trichosanthe kirilowii Maxim.）或双边栝楼（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果实［1］，具清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠之功效。在临床应用中，瓜蒌常和其他中药配伍使用，用于多种疾病的治疗。其中，文献报道用于胸痹症治疗的瓜蒌薤白白酒汤、瓜蒌薤白半夏汤因出自汉代名医张仲景的《金匮要略》而为众人所熟知［2-3］；而出自孙一奎《赤水玄珠·医旨绪余》的瓜蒌红花甘草汤［4］，虽具有清热解毒、润燥止痛的作用，但研究报道相对较少。含瓜蒌的方剂较多，但未见系统研究含瓜蒌方剂的组方规律的相关报道。结合方剂学、中医诊断学开展方剂配伍规律的现代研究是中医药现代化研究的重要组成部分，对中医临床治疗有很大的指导作用，对于继承和发展中药配伍理论、更有效地指导临床和中药新产品研发具有重要意义［5］。为此，本文基于网络药理学和分子对接技术探讨含瓜蒌方剂组方规律及核心药对“瓜蒌-甘草”分子机制，以期为瓜蒌临床配伍用药及其分子机制研究提供参考与借鉴。

1 资料和方法

1.1 数据来源

1.1.1 处方来源 含瓜蒌方剂来源于中国中医科学院中国医史文献研究所中医古籍知识库（以下简称中医古籍知 识 库）（http：//kb350.zywx.org/static/search/index.htm1），该数据库共收载含瓜蒌方剂1310个，含栝楼方剂390个，出自约138个医药学典籍（不同卷的，按同一医药学典籍统计），主要涉及约694味中药。

1.1.2 处方筛选与数据标准化 参照《中国药典》（2015年版）规范处方中的中药名称，如瓜蒌、栝楼统称为瓜蒌，鉴于临床常将瓜蒌皮、瓜蒌子按一定比例合用代替瓜蒌［6］，故将瓜蒌皮、瓜蒌仁、瓜蒌子并入瓜蒌统计；瓜蒌根和天花粉统称天花粉；江子和巴豆统称为巴豆；白芍、赤芍、芍药统称为芍药；干姜、生姜、炮姜统称为姜等。参照《中医病证分类及编码》（中华人民共和国国家标准GBT-15657-1995）对疾病的名称进行了规范，对古方主治的某些疾病，若在《中医病证分类及编码》表中找不到对应疾病的，则按类进行了划分，如：古方中的喘病（化痰顺气，开郁清火定喘）、肺伤（善泄咳、惊恐）、肺痈划为肺系病类；在主治中记载为诸咳痰盛、化痰、痰喘等的，划为痰证类等。

1.1.3 化学成分来源 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditiona1 Chinese Medicine Systems Pharmaco1ogy Database and Ana1ysis P1atform,TCMSP）以“瓜蒌”、“甘草”分别检索瓜蒌、甘草的化学成分，选择符合口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18的化学成分，绘制结构式并以MDL SDfi1e（*.sdf）格式保存。将这些化学成分的MDL SDfi1e（*.sdf）格式结构式导入SwissTargetPrediction数据库，检索符合Probabi1ity≥0.1的化学成分靶点蛋白。

1.1.4 候选靶标来源 通过CooLGeN数据库（http：//ci.smu.edu.cn/genc1ip3/ana1ysis.php）及GeneCards（https：//www.genecards.org/），以“Ph1egm syndrome”（痰证）为关键词收集疾病（人类基因）靶点蛋白，选择与化学成分相匹配的靶点蛋白。

1.2 数据分析

1.2.1 瓜蒌及其核心药对“瓜蒌-甘草”用药规律分析 本文使用中医古籍知识库的检索平台，对含瓜蒌的方剂进行药味使用频次分析、组方及疾病用药规律分析等。统计以瓜蒌入药治疗频率最高的疾病，明确瓜蒌治疗痰证类疾病的核心组合。

1.2.2“瓜蒌-甘草”分子机制分析 利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/too1s.jsp）进 行 靶 点 蛋 白 的GOTERM_BP_DIRECT 富集分析和Kyoto Encyc1opedia of Genes and Genomes（KEGG）_PATHWAY通路注释分析（标示符为officia1_gene_symbo1，物种注释为Homo sapiens）。根据预测结果，使用Gephi0.9.2软件构建化学成分-靶点蛋白-信号通路网络。

2 结果

2.1 含瓜蒌方剂主治病症及用药频次分析

2.1.1 含瓜蒌方剂主治病症分析 通过对中医古籍知识库的检索，含瓜蒌方剂主要用于28种（类）疾病的治疗，这些疾病的出现频次总计为1101次。占出现总频次3%以上的共计11种（类）疾病，其中痰证类134次、消渴病101次、肺系病类（肺痈病）90次、外感热病类89次、疮疡类病70次、乳痈病58次、胸痹心痛病56次、脾证类47次、咳嗽病39次、痈病35次、皮肤病类31次。痰证类出现频次居首，占总频次的14.0%。

2.1.2 含瓜蒌方剂药味频次分析 含瓜蒌方剂共计1700个，去除重复方剂及含瓜蒌根（天花粉）（在中医古籍知识库的检索平台中，检索瓜蒌时，会检索到瓜蒌根并纳入统计）553个，瓜蒌的实际出现频次为1147次，主要涉及与694味中药配伍。使用频次＞150的共有11味中药，其中甘草403次、半夏265次、黄芩222次、茯苓212次、黄连202次、桔梗200次、姜187次、陈皮182次、人参167次、芍药152次。

2.1.3 含瓜蒌方剂核心药对的分析 在“2.1.2”项基础上，通过关联分析，以出现频次占处方量达10%为评价标准，获得含瓜蒌方剂核心药对15个，其中2味药对组合10个，3味药对组合5个。在出现频次统计的基础上，对各药用于主治痰证类疾病的频次进行统计（表1）。

表1 含瓜蒌方剂核心药对的分析Tab.1 Analysis of core drug pairs in prescriptions containing Trichosanthis fructus

2.2 核心组合药对“瓜蒌-甘草”分子机制探讨研究

2.2.1 核心组合药对“瓜蒌-甘草”化学成分 通过TCMSP平台检索到瓜蒌有11个化学成分，甘草有92个化学成分符合OB ≥30%、DL ≥0.18，将这些化学成分的MDL SDfi1e（*.sdf）格式结构式导入SwissTargetPrediction数据库，检索到符合Probabi1ity≥0.1的化学成分靶点蛋白4984个。

通过CooLGeN 数据库中以“Ph1egm syndrome”（痰证）为关键词检索到痰证类疾病靶点蛋白204个。比较化学成分靶点蛋白与痰证类疾病靶点蛋白，有41个蛋白靶点为瓜蒌、甘草化学成分与痰证类疾病共有靶点蛋白，涉及52个化学成分，其中瓜蒌9个、甘草43个（表2）。

将瓜蒌、甘草化学成分与痰证类疾病共有的41个靶点蛋白导入DAVID 数据库，进行靶点蛋白的KEGG_PATHWAY 通 路 注 释 分 析 和 GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析。

2.2.2 KEGG信号通路分析 通过DAVID数据库进行KEGG_PATHWAY富集分析，信号通路结果见图1。主要为Pathways in cancer（P=7.4×10-4）、Graft-versushost disease（P=1.8×10-3）、Acute mye1oid 1eukemia（P=5.5×10-3）、NOD-1ike receptor signa1ing pathway（P=6.7×10-3）、Pancreatic cancer（P=1.0×10-2）等。

2.2.3 Gene Onto1ogy(GO)分析“瓜蒌-甘草”中的52个化 学 成 分 通 过PPARD、NLRP3、PPARG、MMP9、CCND1等靶点蛋白发挥与痰证类疾病相关的生物功能，主要与positive regu1ation of ce11 pro1iferation、positive regu1ation of mo1ecu1ar function、ce11 motion、ce11 migration、regu1ation of ce11 pro1iferation等有关（图2，P＜1.0×10-6）。细胞组成主要与extrace11u1ar space、extrace11u1ar region part、extrace11u1ar region等有关，分子功能主要与steroid hormone receptor activity、1iganddependent nuc1ear receptor activity、monocarboxy1ic acid binding等有关（图3A、B）。

2.2.4 活性成分-靶点蛋白-信号通路网络的构建 使用Gephi 0.9.2 软件构建化学成分-靶点蛋白-信号通路网络。“瓜蒌-甘草”中的52个活性成分通过41个靶点蛋白、17条信号通路发挥与“痰证”相关的作用，网络关系复杂、蛋白靶点与信号通路多（图4）。

2.3“瓜蒌-甘草”药对活性成分与靶点蛋白分子对接结果分析

一般以结合能≤−5 kJ/mo1 或Tota1 Score 值≥5.0作为筛选标准。本文以SYBYL-X 2.1.1 对接软件进行分子对接，获得Tota1 Score值（表3）。分子对接结果表 明，MOL001494、MOL007179、MOL004806、MOL004860、MOL004805等40个化学成分与PPARD、NLRP3、PPARG、MMP9、CCND1 等10 个靶点蛋白的Tota1 Score值≥5.0。Tota1 Score值≥7.0的代表性核心活性成分与靶点蛋白分子对接模式（图5）。

3 讨论

在中医古籍知识库中收载的1700个含瓜蒌方剂中，瓜蒌-甘草配伍应用频次最高，达403次。在《古今医鉴》（第3卷）伤寒（篇）《小柴胡汤》的方剂中，在含有甘草药味的处方基础上进行药味的加减：痰多，加瓜蒌仁。此方功用主治为：治足少阳胆经受证，耳聋胁痛，寒热呕而口苦，脉来弦数，属半表半里，宜和解，此胆经无出入，有三禁，不可汗、下，利小便也。按疾病类别划分，并未划入痰证类疾病中，但鉴于瓜蒌在此方中的作用，主要是用于痰证的治疗，因此，在统计瓜蒌甘草用于哪些疾病治疗时，把此方列入痰证类病统计。其他药味组合也根据药味在处方中的实际作用进行了归纳。在含瓜蒌方剂核心药对中，“瓜蒌-甘草”药对出现频次最高且用于痰证类疾病的频次也较高，达113次。现代文献已有“瓜蒌-甘草”药对配伍用于肺炎的免疫炎症研究的报道［7］，为此，本文主要对核心药对“瓜蒌-苷草”用药规律进行分析。

表2 核心药对“瓜蒌-甘草”化学成分Tab.2 Chemical composition in the core medicine pair"Trichosanthis fructus(A)-Glycyrrhizae radix et rhizoma(B)"

图1“瓜蒌-甘草”活性成分潜在靶点的KEGG信号通路富集分析Fig.1 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of potential target of active components in "Trichosanthis fructus-Glycyrrhizae radix et rhizoma".

图2“瓜蒌-甘草”活性成分潜在靶点的GOTERM_BP_FAT过程富集分析Fig.2 Enrichment analysis of GOTERM_BP_FAT process of potential target of active components in"Trichosanthis fructus-Glycyrrhizae radix et rhizoma".

图3“瓜蒌-甘草”活性成分潜在靶点的GOTERM_CC_FAT（A）和GOTERM_MF_FAT（B）富集分析Fig.3 Enrichment analysis of GOTERM_CC_FAT(A)process and GOTERM_MF_FAT（B）process of potential target of the active components in"Trichosanthis fructus-Glycyrrhizae radix et rhizoma".

瓜蒌用于痰证类相关疾病的治疗在中医药古籍中多有记载，如《本草衍义补遗》：“治嗽之要药”；《本草纲目》：“润肺燥，治咳嗽，涤痰结…”；《本草新编》：“祛痰”；《长沙药解》：“治肺痿，涤痰涎，止咳嗽…”［8］。甘草用于痰证类相关疾病的治疗也有记载，如《汤液本草》：“治肺痿之脓血…”；《医学入门·本草》：“止渴止嗽及肺痿吐脓…”。现代药学典籍中也记载了瓜蒌具清热涤痰之功效，用于肺热咳嗽，痰浊黄稠等的治疗；甘草具袪痰止咳之功效，用于咳嗽痰多等的治疗［1］。

瓜蒌具清热涤痰，宽胸散结等主要功效。邹纯才等［9-10］报道了瓜蒌抗心肌缺血再灌注损伤作用、瓜蒌皮在痰浊内阻证冠心病治疗中的应用等。中药多配伍使用，以便更好发挥药效。瓜蒌薤白、瓜蒌薤白半夏源自张仲景的《金匮要略》，主要用于胸痹症的治疗。基于众多的中医中药古籍中含瓜蒌方剂的组方规律数据分析，深入探讨瓜蒌和哪种或哪些药味配伍且主要用于哪种疾病的治疗，为瓜蒌的组方研究提供参考。

图4“瓜蒌-甘草”药对化学成分（）-靶点蛋白（）-信号通路（）网络Fig.4 Chemical components ( )-target protein ( )-signal pathway () network of"Trichosanthis fructus-Glycyrrhizae radix et rhizoma"drug pair.

由本文含瓜蒌方剂组方规律可见，含瓜蒌方剂的用药规律可循，通过不同配伍达到不同的治疗目的。含瓜蒌方剂主要用于痰证类、消渴病、肺系病类、胸痹心痛病等28种（类）疾病的治疗，主要涉及与甘草、半夏、黄芩等的配伍。在含瓜蒌方剂核心药对中，“瓜蒌-甘草”药对出现频次最高且用于痰证类疾病的频次也较高，达113次。“瓜蒌-甘草”配伍使用，在唐代的《千金翼方》、《外台秘要》中多有记载，在南宋《女科济阴要语万金方》中记载，痰喘气急、痰气串痛、老痰及口吐痈脓或痰血作腥臭者，难治也，加瓜蒌。元朝《风科集验名方》之十一卷，伤寒中风（篇）（方十一首）中关于瓜蒌汤（含瓜蒌-甘草配伍）方的记载，治伤寒中懈五七日，胸中烦躁，干呕，并宜服之。在明朝《有医方集略》、《古今医鉴》、《简明医彀》、《明医杂著》、《寿世保元》、《医林绳墨》、《医宗必读》、《李氏家藏奇验秘方》、《重刻万氏家传济世良方》、《诸症辨疑》、《医家必用》、《救急疗贫易简奇方》、《传信尤易方》、《本草汇言》等诸多医药曲籍中有记载，如明朝中期以前《儒医心镜》（四）各症病原并用药治法要诀（篇）痰饮（章）记载，痰在咽喉间，如绵絮，如梅核，咯不出，咽不下，或升或降，塞碍不能，亦痰气也。后成膈噎病，加瓜蒌。痰饮者，痰在胸胁间，痛而有声也。痰饮与死血皆窠囊，加瓜蒌。湿痰流注症者，凡人骨体串痛，或作寒热，发肿块，皆是湿痰流注经络也，加瓜蒌。明清医籍《商便奇方》（三卷）咳嗽篇记载，痰结，吐难出，加瓜蒌七分。在现代剂型中，由“瓜蒌-甘草”配伍组方的瓜蒌甘草颗粒，具清热化痰、解毒扶正之功效。瓜蒌主治痰热，可通腑泻热、活血化瘀，为主药；甘草可解毒化痰、益气扶正，为辅药。

网络药理学结果显示，“瓜蒌-甘草”中的MOL001494、MOL007179、MOL004806、MOL004805等52个成分作用于PPARD、PPARG、NLRP3、MMP9、CCND1 等41 个蛋白靶点，通过Pathways in cancer、NOD-1ike receptor signa1ing pathway等17条通路发挥治疗痰证类疾病作用，Pathways in cancer通路居首。中医认为痰是癌症发生的病理机制之一，是肿瘤发生发展过程中的病理产物也是新致病因素［11］。不同方剂可能作用于不同的肿瘤转移环节，且同一方剂在不同肿瘤转移环节发挥作用不同［12］。分子对接结果表明，MOL001494、MOL007179、MOL004806、MOL004860、MOL004805等40个化学成分与PPARD、NLRP3、PPARG、MMP9、CCND1 等10 个 靶 点 蛋 白 的Tota1 Score 值≥5.0。MOL001494、MOL007179、MOL004806、MOL004805等11个化合物与PPARD、PPARG、NLRP3、MMP9、CCND1、STAT3、TNF、IL2 等8 个靶点蛋白的Tota1 Score值≥7.0。

PPARD是过氧化物酶体增殖物激活受体家族中重要的一员，它首先被鉴定为通过结合过氧化物酶体增殖物来控制过氧化物酶体的大小和数量的蛋白质，与癌症等多种疾病有关。PPARD基因及其启动子区DNA甲基化是潜在的肺癌早期筛查分子标志物，为肺癌早期临床诊断和治疗提供了科学线索［13］。本文网络药理学研究表明，MOL001494、MOL007179等8种化合物可作用于PPARD靶点蛋白，通过Pathways in cancer，发挥positive regu1ation of ce11 pro1iferation 等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL001494、MOL007179、MOL004355、MOL006756等4种化合物与PPARD 的Tota1 Score 值≥5.0，其中MOL001494、MOL007179 与 与PPARD 的Tota1 Score 值＞10，与PPARD 靶点蛋白具有较强的结合能力，在positive regu1ation of ce11 pro1iferation等生物学功能方面可能发挥重要作用。

表3 各化学成分与靶点蛋白作用的Tota1 Score 值Tab.3 Total Score value of docking between chemical components and target protein

续表3

图5 代表性核心活性成分与靶点蛋白分子对接模式Fig.5 Docking mode between core active components and target protein(Total Score ≥7.0).

NLRP3炎症小体作为天然免疫的重要组成部分，在机体免疫反应和疾病发生发展过程中发挥着重要作用［14-15］，其过度活化可导致多种人类重大疾病如阿尔茨海默病、炎症性肠病、糖尿病以及恶性肿瘤如肺癌等的发生［16］。研究表明蒽醌类化疗药物能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放大量免疫原性物质如HMGB1和ATP，诱导NLRP3炎症小体活化和IL-1β和IL-18等细胞因子产生，从而促进肿瘤微环境中免疫细胞浸润并提高化疗诱导的抗肿瘤免疫［17］。本文网络药理学研究表明，MOL001494、MOL004838 可作用于NLRP3 靶点蛋白，通过NOD-1ike receptor signa1ing pathway，发挥positive regu1ation of mo1ecu1ar function等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL001494、MOL004838与NLRP3具有较强的结合能力，在positive regu1ation of mo1ecu1ar function 等生物学功能方面可能发挥作用。

CCND1已被公认为是一种原癌基因，主要功能是促进细胞增殖，但其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。研究表明，在多种肿瘤中发现了CCND1基因过表达和基因扩增，包括胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等［18］。医学上也提出以CCND1异常表达作为诊断癌症一项指标的设想，以及研究CCND1在细胞周期调控中的作用，从而寻找出治疗癌症的药物［19］。本文网络药理学研究表明，MOL004805、MOL004855等14种化合物可作用于CCND1靶点蛋白，通过Pathways in cancer，发挥positive regu1ation of ce11 pro1iferation 等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL004805、MOL004855等10种化合物与CCND1的Tota1 Score 值≥5.0，与CCND1 具有较强的结合能力，在positive regu1ation of ce11 pro1iferation等生物学功能方面可能会发挥作用。

STAT3被认为在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中发挥致癌作用，因此，靶向STAT3被认为是一种干预治疗途径。但Beatrice Grabner等却发现在KRAS突变的肺腺癌中，STAT3 具有意想不到的肿瘤抑制作用：STAT3改变了肿瘤的微环境和肿瘤血管的生成，通过阻断细胞质中的P65来降低NF-κB的活性，最终抑制Kras诱导的肺癌发展［20］。本文网络药理学研究表明，MOL004805、MOL004808作用于STAT3靶点蛋白，通过Pathways in cancer，发 挥ce11 motion、positive regu1ation of biosynthetic process等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL004805、MOL004808与STAT3的Tota1 Score 值分别为7.7656、6.8389，与STAT3具有较强的结合能力，在恶性肿瘤的治疗中可能会发挥作用。

TNF-α是一种具有多种生物学功能的细胞因子，不但可以诱导细胞炎性因子的产生，还参与了细胞的增殖、存活以及凋亡等生物学反应［21-22］。本文网络药理学研究表明，MOL004848、MOL004827等6个化学成分作用于TNF靶点蛋白，通过Graft-versus-host disease，发挥positive regu1ation of ce11 pro1iferation、positive regu1ation of mo1ecu1ar function等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL004848、MOL004827等5个化学成分与TNF的Tota1 Score 值＞5，与TNF具有较强的结合能力，在positive regu1ation of ce11 pro1iferation、positive regu1ation of mo1ecu1ar function中可能会发挥作用。

IL2是抗肿瘤效应的重要因子［23］，可激活多种效应细胞如细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞等［24］。本文网络药理学研究表明，MOL004855、MOL004864等11个化学成分作用于IL2 靶点蛋白，通过Graft-versus-host disease、A11ograft rejection 等作用通路，发挥positive regu1ation of ce11 pro1iferation、positive regu1ation of mo1ecu1ar function等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL004855、MOL004864等6个化学成分与IL2的Tota1 Score 值＞5，与IL2具有较强的结合能力，在恶性肿瘤的治疗中可能会发挥作用。

MMP-9 与肺癌的发生发展紧密相关，可用于判断肺癌病理分型及分期［25］。MMP9 过表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关［26］，MMP9为明胶酶类分子，由可能存在恶性倾向的肿瘤细胞、巨噬细胞分泌，参与ECM降解过程，破坏基底膜完整性，在恶性肿瘤的血管化、肿瘤细胞的浸润及转移灶的形成过程中起重要作用［27］；同时，MMP9可促成肿瘤新生血管形成，导致血管局部基底膜降解，创造促血管生成微环境，促成肿瘤细胞的侵袭、转移［28］。本文网络药理学研究表明，MOL004860、MOL004815等23个化学成分作用于MMP9靶点蛋白，通过Pathways in cancer，发挥regu1ation of 1ocomotion、regu1ation of apoptosis等生物学功能。本文进一步通过分子对接技术预测MOL004860、MOL004815等16个化学成分与MMP9的Tota1 Score 值＞5.0，与MMP9具有较强的结合能力，在恶性肿瘤的治疗中可能会发挥作用。

在化学成分-靶点蛋白-信号通路网络的基础上，进一步通过分子对接技术研究表明，MOL001494、MOL007179、MOL004806、MOL004860、MOL004805等40个化学成分与PPARD、NLRP3、PPARG、MMP9、CCND1等10个靶点蛋白的Tota1 Score值≥5.0，结合程度较高，可能为“瓜蒌-甘草”药对发挥治疗“痰症类”疾病的主要物质基础。《黄帝内经·灵枢·刺节真邪》云：“已有所结，气归之，津液留之，邪气中之，凝结日以易甚，连以聚居，为昔瘤，以手按之坚。”朱丹溪提出：“凡人身上、中、下有块者，多属痰证”，认为气滞津结痰凝可致肿瘤。基于网络药理学及分子对接技术的“瓜蒌-甘草”配伍用于“痰症类”疾病治疗机制研究可为从痰论治肿瘤提供一个新角度和新思路。