改良第八代粘接剂对龋影响牙本质粘接性能的影响*

李小龙 余 梅 段 劲

临床上最常见的牙体病理性改变是龋，对于龋齿的治疗，最常见的方法是树脂充填修复［1］。在牙本质龋外层的是龋感染牙本质，内层的是龋影响牙本质［2］。在牙科微创理念中，由于龋影响牙本质具有再矿化能力，因此建议去腐时保留龋影响牙本质，作为粘接的基底［3］。在牙本质龋发生的过程中，龋影响牙本质由于脱矿，形成了更高的孔隙率，同时脱矿牙本质中的胶原纤维由于酸的作用，改变了其正常的结构。因此，龋影响牙本质与正常牙本质在结构及成分含量上存在本质上的不同［4］。

在龋发生的过程中，由于龋影响牙本质发生了脱矿，导致龋影响牙本质的硬度较正常牙本质低，因此粘接后，粘接剂对龋影响牙本质的粘接强度也较正常牙本质低［5］。另外，龋影响牙本质的病理过程伴随着再矿化，沉积的矿物质会堵塞牙本质小管，降低了粘接剂中树脂单体对龋影响牙本质小管的渗透能力，粘接后形成的树脂突长度及微锁结强度也会下降［6，7］。因此提高树脂粘接剂对龋影响牙本质的粘接强度在临床上有着重要的意义。

在自酸蚀粘接剂的粘接过程中，酸蚀与树脂单体渗透的过程同时进行，因此玷污层并没有被去除，树脂单体和改良的玷污层最终形成混合层［8］。由于树脂渗透深度与酸蚀深度并不匹配，因此，在混合层与脱矿牙本质之间形成了一层裸露的胶原纤维，即微渗漏。微渗漏中的胶原纤维容易被牙本质内源性基质金属蛋白酶（MMPs）及内源性水分所酶解和水解。由于龋影响牙本质存在脱矿现象，粘接后形成的混合层也较正常牙本质厚，因此在龋影响牙本质中形成的混合层更加容易被酶解及水解［9］。如何抑制酶解及水解作用，增加粘接耐久性，也是各国研究者对粘接剂研究的重点。

EGCG是一种绿茶提取物，是绿茶多酚的主要活性物质，具有抗氧化作用，MMPs 酶抑制作用等［10］。研究表明EGCG可以有效抑制体内MMPs的活性，在抑制肿瘤细胞转移中发挥着显著效果［11］。同时，EGCG也是一种胶原蛋白交联剂，可以提高胶原蛋白的交联度，降低水解作用［12］。因此，作为一种天然的MMPs抑制剂，EGCG是否能提高SBU对龋影响牙本质的粘接性能是本实验研究的内容。

1.材料与方法

1.1 材料Single Bond Universal（3MESPE，美国）；P60（3MESPE，美国）；EGCG（Sigma，美国）；中龋离体牙；微拉伸仪（Bisco，美国）；激光共聚焦显微镜（Leica，德国）；慢速线性切割机（Struers，丹麦）；龋指示剂（Voco，德国）；光固化灯（3MESPE，美国）；体视显微镜（Leica，德国）；扫描电镜（电子株式会社，日本）。

1.2 方法

1.2.1 配置试剂 配置含有终浓度为100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml EGCG 的SBU 粘接剂，以不含EGCG的SBU粘接剂为对照组。

1.2.2 粘接强度测试 在龋指示剂下制备龋影响牙本质。将制备好的离体牙随机分组，按照分组进行粘接，上方堆塑树脂。用慢速线性切割机在流动水下沿牙体长轴进行切割，制备微拉伸试件（0.9mm×0.9mm）。在体视显微镜下将有粘接缺陷试件排除。将试件浸泡于超纯水中24h。在微拉伸仪下进行检测，计算微拉伸强度。

1.2.3 断裂界面观察 将所有微拉伸后断裂试件在扫描电镜下观察断裂界面的显微结构。

1.2.4 微渗漏检测 收集人中龋离体牙，按照实验2方法进行牙齿处理及粘接，用慢速线性切割机在流动水下沿牙体长轴进行切割，制备成约1mm厚度牙本质试件。将试件浸泡于含有1%罗丹明-B-异硫氰酸酯的50%乙醇溶液中，染色24h，流动水下清洗，去除未染色的多余染料。在激光共聚焦显微镜下观察微渗漏。

1.3 统计学处理方法 用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 EGCG 对SBU 粘接强度的影响 实验组的微拉伸强度显示于表1中。如图所示，EGCG添加后SBU对龋影响牙本质粘接的微拉伸强度明显提高（P＜0.0001，F=17.11），随着添加EGCG浓度的升高，SBU 对龋影响牙本质粘接强度显著增强（P=0.0141，F=5.013）。但是EGCG 200μg/ml组与EGCG 300μg/ml组之间的粘接强度没有统计学差异（P=0.8698）。

表1 添加不同浓度EGCG后SBU对龋影响牙本质微拉伸强度（MPa，)

表1 添加不同浓度EGCG后SBU对龋影响牙本质微拉伸强度（MPa，)

注：与对照组比较，差异有统计学意义（a，P＜0.0001；与EGCG 100μg/ml组比较差异有统计学意义（b，P＜0.05）

2.2 断裂界面微观形态观察 断裂界面观察的冷场发射扫描电镜图片显示于图1中。如图所示，在对照组中，断裂界面位于混合层下层，在图中可以观察到空虚的牙本质小管，树脂突从牙本质小管内完全脱离，同时可以观察到龋影响牙本质小管中沉积物，牙本质小管并不均一。在EGCG 100μg/ml组中可以观察到断裂界面位于混合层中，图片中显示有空虚的牙本质小管，同时也有粘接剂界面断裂，部分树脂突从于牙本质小管内脱离。在EGCG 200μg/ml及EGCG 300μg/ml组中，断裂界面位于混合层上层或者树脂层中，可见断裂的粘接剂或者树脂，树脂突基本存留与牙本质小管内，树脂突与牙本质小管的嵌合程度较高，粘接强度也较高。

图1 微拉伸断裂界面扫描电镜图片。A、对照组；B、EGCG 100 μg/ml组；C、EGCG 200 μg/ml组;D、EGCG 300 μg/ml组。图中D为牙本质，R为树脂，H为混合层，白色箭头显示空虚牙本质小管，黑色箭头显示有树脂突牙本质小管。

2.3 粘接微渗漏结果 粘接界面激光共聚焦显微镜观察结果显示于图2中。如图所示，龋影响牙本质粘接界面并不均匀一致。与对照组相比较，添加了EGCG后粘接界面微渗漏明显减少，随着EGCG浓度的升高，粘接界面微渗漏持续减少。但添加200μg/ml及300μg/ml浓度EGCG间没有明显区别。

图2 微渗漏激光共聚焦图片。A、对照组；B、EGCG 100 μg/ml组；C、EGCG 200 μg/ml组;D、EGCG 300 μg/ml组。图中D为牙本质，R为树脂，白色箭头显示微渗漏。

3.讨论

龋齿是口腔临床上最常见的病理性改变，龋影响牙本质是口腔粘接修复最常见的粘接基底。在龋齿发生的过程中，龋影响牙本质发生部分脱矿，孔隙率增高，因此，在龋影响牙本质中形成的混合层较正常牙本质厚，更加容易被牙本质内激活的MMPs酶解，降低粘接耐久性［4,13］。另外，龋影响牙本质发生再矿化现象，抗酸性矿物沉积于牙本质小管中，同时伴随着脱矿牙本质胶原纤维结构的改变，不利于树脂粘接剂的酸蚀，降低粘接剂树脂单体对脱矿牙本质的渗透［7］。上述原因影响了树脂粘接剂对龋影响牙本质的粘接性能，降低粘接强度［6］。同时，牙本质内固有水分也较容易水解粘接后的胶原纤维层，影响粘接耐久性［14］。因此，如何提高树脂粘接剂对龋影响牙本质的粘接强度及粘接耐久性是口腔临床上的一大挑战［9］。

为了提高树脂粘接剂对正常牙本质的粘接强度，在国外研究中有研究者将EGCG预处理后进行全酸蚀或者自酸蚀粘接剂的粘接，发现可以提高粘接剂的粘接强度［15］。但是没有研究将EGCG直接混入第八代粘接剂中，研究EGCG是否能提升第八代粘接剂SBU的粘接强度及EGCG对SBU的理化性能是否会有影响。在本实验中发现，添加EGCG后，SBU对龋影响牙本质的粘接强度明显提升。EGCG作为一种天然交联剂，可通过氢键或者疏水键与脱矿牙本质胶原纤维结合，形成不溶性复合物，维持胶原纤维的结构稳定，提高酸蚀后树脂单体对牙本质胶原纤维及小管的渗透能力，形成更加稳定的牙本质-树脂微锁结，以及形成更加稳定的牙本质小管-树脂突复合体，从而提升树脂粘接剂对龋影响牙本质的粘接强度［14］。

粘接界面的降解是由两种机制引起，一种是混合层中树脂粘接剂的水解作用，另外一种是混合层中裸露胶原的酶解作用。内源性基质金属蛋白酶，特别是MMP-2/MMP-9在龋发生或者酸蚀的过程中被激活，从而产生溶胶原活性［16］。为了克服酶降解的问题，合成MMPs抑制剂，如氯己定或天然类型，如原花青素，已被提出用于处理龋影响牙本质或者正常牙本质，延缓混合层的降解，保持混合层的稳定性，增加粘接耐久性［17，18］。EGCG作为一种天然的MMPs抑制剂，在抗肿瘤活性及抗氧化作用中被广泛研究［19］。EGCG在体内有较强的MMP-2/MMP-9抑制活性。因此，国内外研究者也正在研究EGCG作为一种MMPs抑制剂是否能提高粘接剂混合层的抗酶解作用，稳定混合层的结构，提高粘接耐久性。在Santiago的研究中发现，EGCG预处理可以提高树脂粘接剂对正常牙本质的粘接耐久性［20］。本实验结果显示，SBU添加EGCG后可明显降低形成混合层的微渗漏，有利于抑制牙本质内源性的酶解作用及水解作用，保持脱矿牙本质胶原纤维的稳定性。EGCG的酶抑制作用机制仍不完全明确，有研究提出MMPs的激活依赖于锌离子的，多酚类物质有较强的金属离子螯合作用，因此，EGCG有可能是通过与锌离子的螯合作用，抑制MMPs活性［21］。在本研究中，作者猜想EGCG也有可能是通过与锌离子的螯合作用，抑制MMPs活性。但是EGCG是否能提高SBU对牙本质的粘接耐久性仍需后续研究进行验证。

4.结论

EGCG作为一种基质金属蛋白酶抑制剂和天然交联剂，可以明显提升龋影响牙本质中脱矿牙本质胶原纤维的交联度，降低牙本质内源性MMPs酶和余留水分子对裸露胶原纤维的酶解和水解作用，明显提高了SBU对龋影响牙本质的粘接强度，减少微渗漏，提升了第八代粘接剂SBU的粘接性能，对临床有一定实际应用价值。