LINC00339调控miR-195-5p对高糖作用的成骨细胞增殖和凋亡的影响

窦越超 王雪飞

糖尿病性骨质疏松症(diabetes osteoporosis，DOP)是糖尿病的一种并发症，是由于血糖升高导致骨组织代谢紊乱而引起的骨组织结构破坏、骨量减少、骨脆性增加、易引发骨折为特征的全身性骨骼疾病，严重影响患者生活质量，目前尚无有效药物治疗DOP，亟需开发新的治疗药物和方法[1]。成骨细胞是促进骨形成的主要功能细胞，成骨细胞凋亡是引起骨质疏松的重要原因，研究成骨细胞的凋亡机制对预防和治疗骨质疏松症具有重要意义[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)参与了多种生物学过程，与骨质疏松也密切相关，可作为骨质疏松(osteoporosis，OP)骨代谢过程中的生物标志物，为OP诊断、治疗及判断预后提供新的靶标[3]。有研究报道rs3820282是染色体1p36.12上具有最强子宫内膜异位症风险关联的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，通过细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42，CDC42)和LINC00339的反向调节起作用[4]。染色体1p36.12的骨质疏松症风险SNP rs6426749-G等位基因可以提高LINC00339的表达，而LINC00339的下调可促进骨代谢关键调节因子CDC42的表达，表明LINC00339可能与骨质疏松症有关[5]。但目前笔者未发现LINC00339对成骨细胞生物行为的影响及其机制还未有研究。研究发现miR-195-5p通过靶向成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移并促进细胞凋亡，其可作为子宫内膜癌的治疗靶点[6]。上调miR-195-5p通过降低其靶基因骨形态发生蛋白受体-1α(bone morphogenetic protein receptor-1α，Bmpr1α)的表达可降低骨髓间充质干细胞的成脂分化，改善骨质疏松症状[7]。本实验旨在研究LINC00339和miR-195-5p对成骨细胞增殖、凋亡的影响及LINC00339是否通过调控miR-195-5p影响成骨细胞的增殖和凋亡。为骨质疏松的预防和治疗提供新思路和新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 成骨细胞hFOB1.19购自上海通派生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Sigma公司；胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Lipofectamine TM 2000转染试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；二辛可宁酸(BCA)试剂盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)、十二烷基硫酸钠，钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳(dodecyl sulfate,sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)试剂盒、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体均购自北京博奥森生物科技有限公司；载体质粒均购自上海斯信生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。Bio-Rad2550型全自动酶标仪、FACSCanto Ⅱ流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组:将hFOB1.19细胞在37℃的培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，每隔2～3 d传代1次，将融和至80%的细胞无血清饥饿培养24 h，用终浓度为22 mmol/L的葡萄糖溶液培养细胞48 h作为高糖组，同时以终浓度为5 mmol/L的葡萄糖溶液处理作为对照组。将pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00339、si-NC、si-LINC00339分别转染至正常hFOB1.19细胞中，记为pcDNA3.1组，pcDNA3.1-LINC00339组、si-NC组、si-LINC00339组。将si-NC、si-LINC00339转染至高糖处理的hFOB 1.19细胞中，记为高糖+si-NC组、高糖+si-LINC00339组；将si-LINC00339与anti-miR-NC、anti-miR-195-5p分别共同转染至高糖处理的hFOB1.19细胞中，记为高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC、高糖组+si-LINC00339+anti-miR-195-5p组；转染按Lipofectamine TM 2000转染试剂盒进行。

1.2.2 荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-195-5p和LINC00339的表达水平:提取总RNA，将RNA逆转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，miR-195-5p和LINC00339分别以U6和GAPDH为内参，每个样品设3个重复，循环条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量用2-ΔΔCt法计算。miR-195-5p上游引物序列：5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTGGTAGGGTGCTCGCTT-3’，下游引物序列：5’-CGGCAGCAACTGGTGTCGTGGA-3’；LINC00339上游引物序列：5’-GGTTGACGAAGTCTGGAACG-3’，下游引物序列：5’-GCCCATCATTTCATTGGGTA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物序列：5’-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3’。

1.2.3 蛋白质印迹(Western Blot)检测细胞周期素D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达水平:各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品用SDS-PAGE电泳转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗4℃过夜，TBST洗涤3次；加入二抗室温孵育90 min，TBST洗涤3次，用ECL发光法染色，用ChemiDoc XRS+系统成像，用Quantity One凝胶分析软件处理，检测蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

1.2.4 MTT检测细胞活性:各组细胞培养24 h、48 h、72 h时，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，置于37℃培养箱培养4 h；1 000 r/min离心10 min，吸弃培养液，每孔加150 μl的DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪上检测490 nm波长的吸光度(OD)值。细胞活性(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次，每次设3个复孔。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡:各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，与500 μl的结合缓冲液混匀。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.6 荧光素酶报告基因检测实验检测LINC00339对miR-195-5p的靶向调控:构建LINC00339野生型和突变型3′UTR荧光素酶表达载体WT-LINC00339和MUT-LINC00339，用LipofectamineTM 2000将WT-LINC00339和MUT-LINC00339分别与miR-NC和miR-195-5p共转染至转染hFOB1.19细胞中。按照说明书操作检测荧光活性，实验重复3次。

2 结果

2.1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的细胞hFOB1.19中的表达 与对照组比较，高糖组细胞hFOB1.19中LINC00339表达水平显著升高，miR-195-5p表达水平显著降低(P<0.05)。在高糖作用的细胞hFOB1.19中LINC00339高表达，miR-195-5p低表达。见表1。

表1 LINC00339、miR-195-5p在高糖作用的细胞hFOB1.19中的表达

2.2 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖的影响 与高糖+si-NC组比较，高糖+si-LINC00339组细胞hFOB1.19中LINC00339表达水平显著降低，Cyclin D1表达水平显著升高，P21表达水平显著降低，细胞活性显著升高(P<0.05)。抑制LINC00339表达促进高糖作用的细胞hFOB1.19增殖。见图1，表2。

图1 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖蛋白表达的影响；1 高糖+si-NC，2 高糖+si-LINC00339

表2 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖的影响

2.3 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表达的影响 与高糖+si-NC组比较，高糖+si-LINC00339组细胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表达水平显著升高，Bax表达水平显著降低，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。抑制LINC00339抑制高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡及促进BMP-2表达。见图2，表2。

图2 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表达的影响；A 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡的影响;B 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表达的影响

表3 抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡及BMP-2的表达的影响

2.4 LINC00339靶向、调控miR-195-5p TargetScan数据库预测显示LINC00339与miR-195-5p有结合位点。转染野生型和突变型表达载体WT-LINC00339和MUT-LINC00339后，与miR-NC组比较，miR-195-5p组转染野生型细胞hFOB1.19的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型细胞hFOB1.19的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-LINC00339组miR-195-5p表达水平显著降低；与si-NC组比较，si-LINC00339组miR-195-5p表达水平显著升高(P<0.05)。LINC00339可靶向调控miR-195-5p。见图3，表4、5。

图3 LINC00339靶向miR-195-5p

表4 荧光素酶报告实验

2.5 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖的影响 与高糖+si-NC组比较，高糖+si-LINC00339组细胞hFOB1.19中miR-195-5p表达水平显著升高，Cyclin D1表达水平显著升高，P21表达水平显著降低，细胞活性显著升高(P<0.05)；与高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC组比较，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p组细胞hFOB1.19中miR-195-5p表达水平显著降低，Cyclin D1表达水平显著降低，P21表达水平显著升高，细胞活性显著降低(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖的促进作用。见图4，表6。

表5 LINC00339调控miR-195-5p的表达

表6 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖的影响

图4 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19增殖蛋白表达的影响；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

2.6 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡的影响 与高糖+si-NC组比较，高糖+si-LINC00339组细胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表达水平显著升高，Bax表达水平显著降低，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC组比较，高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p组细胞hFOB1.19中BMP-2、Bcl-2表达水平显著降低，Bax表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡的抑制作用。见表7，图5。

表7 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡及BMP-2表达的影响

图5 抑制miR-195-5p能逆转抑制LINC00339对高糖作用的细胞hFOB1.19凋亡蛋白及BMP-2表达的影响；1 高糖+si-NC；2 高糖+si-LINC00339；3 高糖+si-LINC00339+anti-miR-NC；4 高糖+si-LINC00339+anti-miR-195-5p

3 讨论

DOP以高血糖和骨密度减低为特点，近些年来，DOP发病率升高，且易致病理性骨折、致残率高，深入研究其发病机制，控制血糖和OP相关危险因素，有利于防治DOP[8]。有研究表明高糖高脂可抑制成骨细胞分化能力[9]；高糖高脂还可时间依赖性抑制成骨细胞增殖，促进凋亡[10]。本实验结果显示，在高糖作用的成骨细胞hFOB1.19中LINC00339表达水平显著升高，miR-195-5p表达水平显著降低。提示，LINC00339和miR-195-5p可能参与成骨细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程。

有研究报道LINC00339在非小细胞肺癌组织和细胞中显著上调，LINC00339沉默通过靶向miR-145调控FOXM1在体外和体内抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭，加速细胞凋亡，抑制肿瘤生长[11]。LINC00339在胶质瘤组织以及胶质瘤细胞系中也上调表达，敲除LINC00339抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和管形成[12]。LINC00339通过miR-1182/SKA1途径促进肝细胞癌的生长和侵袭[13]；LINC00339过表达通过miR-377-3p促进三阴性乳腺癌增殖，抑制细胞周期停滞和抑制细胞凋亡[14]。本实验结果显示，在高糖处理的成骨细胞hFOB1.19中转染si-LINC00339后，细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低。且细胞周期素D1(CyclinD1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)表达水平显著升高，P21、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assiociated X protein，Bax)表达水平显著降低；抑制LINC00339表达，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)表达水平显著升高，而BMP-2可在体内和体外促进间充质干细胞向成骨细胞分化[15]。说明抑制LINC00339表达促进了成骨细胞增殖，抑制了高糖作用的成骨细胞凋亡。

有研究报道miR-195通过靶向SMAD7可促进人骨髓间充质干细胞成骨分化[16]。miR-195-5p高表达可以抑制膀胱癌细胞增殖、促进细胞凋亡[17]。lncRNA XIST通过miR-195-5p靶向YAP促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭[18]。本实验结果显示，LINC00339靶向调控miR-195-5p，在高糖作用的成骨细胞中，同时抑制miR-195-5p和LINC00339的表达，Cyclin D1、Bcl-2、BMP-2表达水平显著降低，P21、Bax表达水平显著升高，细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高。即抑制miR-195-5p逆转了抑制LINC00339对高糖作用的成骨细胞增殖促进和凋亡抑制的作用。说明LINC00339可能通过调控miR-195-5p影响成骨细胞的增殖和凋亡。

综上所述，抑制LINC00339可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，对高糖作用的成骨细胞有保护作用，其机制可能与miR-195-5p表达水平有关。将可为骨质疏松症的预防和治疗提供新策略和新思路。