培养基配方对贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028脂肽产量和抑菌活性的影响

陈燕萍 陈梅春 蓝江林 郑梅霞 刘波 王阶平

摘 要：探究培養基配方对贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028脂肽产量和抑菌活性的影响，筛选出菌株产脂肽的最佳培养基配方。通过酸沉淀、醇溶法提取菌株FJAT-45028发酵产生的粗脂肽，利用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）测定脂肽组成和含量，并以龙眼致腐菌小新壳梭孢菌为指示菌，评估脂肽的抑菌活性。结果表明：贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028在供试的12种培养基中发酵后均能产生脂肽，粗脂肽产量范围为2.28～4.86 g·L-1，抑菌圈直径范围为12.46～20.02 mm。LC-QTOF-MS分析结果显示，菌株FJAT-45028产生的脂肽由伊枯草菌素、丰原素和表面活性素组成，不同培养基中产生的伊枯草菌素、丰原素和表面活性素的含量范围分别是0.46～63.49 mg·L-1、34.07～918.86 mg·L-1和7.00～53.24 mg·L-1。相关性分析表明，伊枯草菌素和丰原素含量以及脂肽总量均与抑菌活性呈显著正相关（P<0.01）。以抑菌活性和脂肽产量为指标，筛选出贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028产脂肽的最佳培养基配方为：蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。该研究筛选到了适于产抑菌脂肽的培养基，为菌株FJAT-45028抑菌脂肽的生产奠定了基础。

关键词：贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028;脂肽产量;培养基组分;抑菌活性

中图分类号：S 476.1   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）12-0026-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.005

Effect of Culture Medium Formula on Yield and Antibacterial Activity of theLipopeptides Produced by Bacillus velezensis FJAT-45028

CHEN Yan-ping， CHEN Mei-chun， LAN Jiang-lin， ZHENG Mei-xia， LIU Bo， WANG Jie-ping*

（Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy ofAgricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In this study， effect of culture medium formula on yield and antibacterial activity of the lipopeptides produced by Bacillus velezensis FJAT-45028 was investigated to obtain the optimal medium for production of the antibacterial lipopeptides. The crude lipopeptides were extracted by acid precipitation and alcoholysis. Their component and content were determined using a liquid chromatography coupled with a quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry （LC-QTOF-MS）. The antifungal activity of the lipopeptides was evaluated byusing Neofusicoccum parvum as an indicator， which is a rot-causing fungus of the Longan fruits. The results showed that the strain FJAT-45028 could yield lipopeptides in the twelve tested culture media. Moreover， content of the crude lipopeptides varied from 2.28 g·L-1 to 4.86 g·L-1， and the diameters of inhibition zone varied from 12.46 mm to 20.02 mm. The results of LC-QTOF-MS detection indicated that the lipopeptides produced by FJAT-45028 were composed by iturin， fengycin and surfactin， and their contents in the twelve culture media varied within the range of 0.46-63.49 mg·L-1， 34.07-918.86 mg·L-1， and 7.00-53.24 mg·L-1， respectively. The correlation analysis indicated that the contents of iturin， fengycin and total lipopeptides were significantly positive correlation with the antifungal activities （P<0.01）. Finally， an optimal medium formula for production of the lipopeptides with antifungal activities by B. velezensis FJAT-45028 was as follow： Sucrose 20 g·L-1， yeast extract 20 g·L-1， beef extract 15 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1， FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1， according to the antifungal activities and yield of the lipopeptides. In conclusion，the suitable medium for production of the antifungal lipopeptides was established， which laying the foundation for the industrial production of the antifungal lipopeptides from the strain FJAT-45028.

Key words： Bacillus velezensis FJAT-45028; Yield of lipopeptide; Components of the culture medium; Antibacterial activity

芽胞杆菌脂肽具有广谱抗菌活性、稳定性好、不易产生耐药性、对人畜毒性低且对环境友好等优点，可用于防治水果采后病害。例如，枯草芽胞杆菌fmbJ产生的脂肽可延缓桃子的腐烂，防腐效率达76.5%[1];贝莱斯芽胞杆菌HN-2的脂肽对芒果炭疽菌具有强拮抗作用[2];解淀粉芽胞杆菌BA168产生的丰原素fengycin能够有效抑制苹果采后病害青霉病原菌的生长[3]。

芽胞杆菌脂肽是通过非核糖体途径合成的，优化菌株培养条件，能够大幅度提升脂肽产量。例如，枯草芽胞杆菌YHI在无碳源供应时，菌体几乎不产脂肽，添加淀粉+米糠油为碳源后，脂肽产量比以葡萄糖为碳源高出104.4%[4];枯草芽胞杆菌T500在基础培养基中添加蛋白胨和酵母粉进行优化后，表面活性素surfactin的产量提高了48.2%，伊枯草菌素iturin的产量提高了180.9%，同时还检测到了基础培养基发酵时无法产生的丰原素[5]。本实验室筛选获得了1株能够有效抑制龙眼采后致腐病原菌小新壳梭孢菌Neofusicoccum parvum生长的贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028，该菌发挥拮抗作用的主要活性成分为脂肽。为提升该菌株的脂肽产量和抑菌活性，本研究利用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS/MS）技术，分析了菌株FJAT-45028在12种不同培养基中的脂肽组成和产量，并结合抑菌活性，筛选出菌株FJAT-45028产脂肽的最佳培养基配方，为脂肽在龙眼采后病害的防控应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis FJAT-45028、龙眼采后致腐菌小新壳梭孢菌Neofusicoccum parvum FJAT-3531，均由福建省农业科学院农业生物资源研究所实验室分离、保存。

本试验所需的培养基配方见表1，各培养基试剂均购买于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 （1）贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028培养：菌株FJAT-45028接种至50 mL LB液体培养基中，30℃、170 r·min-1 振荡培养24 h，作为种子液。按1%接种量接种至50 mL不同的培养基中（表1），25℃、170 r·min-1 振荡培养48 h。（2）小新壳梭孢菌FJAT-3531培养：FJAT-3531接种至50 mL的PDA培养基中，30℃、170 r·min-1培养48 h，浓度调整为107 CFU·mL-1备用。

1.2.2 脂肽制备 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028发酵液离心弃去菌体得上清液，上清液加2 mol·L-1盐酸至pH<2，4℃静置24 h，离心得沉淀，加入磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶解后，经低温真空冷冻干燥后为粗脂肽粉末，称重记录所得粗脂肽产量。

1.2.3 脂肽组成测定 参照文献Chen等[6]方法，利用LC-QTOF-MS/MS技术进行脂肽组成和含量测定。脂肽iturin、fengycin和surfactin的含量定义为每升上清液所含有的脂肽量（mg·L-1）。

1.2.4 抑菌活性检测 采用抑菌圈法进行贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028脂肽对小新壳梭孢菌FJAT-3531的抑菌活性测定。吸取准备好的病原菌悬浮液适量，加入到50℃左右的半固体PDA培养基中（琼脂含量0.9%），使得病原菌终浓度为5×105 CFU·mL-1，并倒置于已凝固的PDA固体培养基上（琼脂含量1.8%）。待培养基凝固后，采用直径为7 mm的打孔器进行打孔，分别在孔中注入甲醇溶解的浓度为30 mg·mL-1的脂肽溶液80 μL，无菌甲醇溶液为空白对照，以0.5 mg·mL-1的潮霉素为阳性对照，每个处理重复3次，30℃培养3 d后，测抑菌圈直径。

1.2.5 数据分析 采用DPS 18.10软件，Duncan新复极差法进行方差分析，多元回归法进行脂肽含量和抑菌活性相关性分析。

2 结果与分析

2.1 培养基配方对贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028粗脂肽产量的影响

由表2可知，菌株FJAT-45028在12种培养基中均能产生脂肽，不同培养基的粗脂肽产量范围为2.28～4.86 g·L-1，其中最高产量的是最低产量的2.13倍;菌株FJAT-45028在K、L、F和C这4种培养基中的粗脂肽产量显著高于其他培养基（P<0.05），这4种培养基的脂肽产量无显著差异（P>0.05）;而利用H和B培养基发酵的脂肽产量最低，仅为2.31 g·L-1和2.28 g·L-1。对培养基组分进行分析，发现在培养基中添加甘油或山梨醇能显著提高脂肽的产量。

2.2 培养基配方对贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028抑菌活性的影响

由表3可知，菌株FJAT-45028在不同培养基中产生的脂肽对龙眼致腐菌小新壳梭孢菌均有抑菌活性，其抑菌圈直径范围为12.46～20.02 mm;菌株FJAT-45028在培养基F中产生的脂肽抑菌活性显著高于其他培养基（P<0.05），抑菌圈直径为20.02 mm;其次，其他培养基所产脂肽抑菌活性仅次于培养基F的有C、J、I、G、L、K、H，该菌在这7组培养基中脂肽抑菌活性无显著性差异（P>0.05）;而利用培养基A和B所产脂肽的抑菌活性最差，抑菌圈直徑仅为13.53 mm和12.46 mm。对培养基组分进行分析，发现富含碳源、氮源和无机盐的培养基产生的脂肽具有较好的抑菌效果。综合考虑粗脂肽产量和抑菌活性，筛选的贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028产脂肽最佳培养基配方为F培养基，即蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。

2.3 培养基配方对贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028产脂肽组成含量的影响

从表4可知，12种培养基产生的脂肽均含有伊枯草菌素、丰原素、表面活性素三大家族化合物，脂肽总含量范围在41.52～988.18 mg·L-1，最大含量是最低含量的23.8倍。伊枯草菌素含量范围在0.46～63.49 mg·L-1，其中菌株FJAT-45028在培养基中伊枯草菌素含量大小前四者的依次为L>C>F>K;丰原素含量范围在34.07～918.86 mg·L-1，各培养基中丰原素含量大小前四者的依次为F>K>L>C;表面活性素含量范围在7.00～53.24 mg·L-1，各培养基中表面活性素含量大小前四者的依次为C>J>I>K。分析发现，伊枯草菌素和丰原素含量在前四者的培养基均为F、K、L、C，伊枯草菌素、丰原素、表面活性素含量最低者均为B培养基，说明富含碳源、氮源及无机盐的培养基有利于贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028脂肽组分中伊枯草菌素和丰原素的合成。

2.4 贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028脂肽组分含量与抑菌活性相关性分析

脂肽对龙眼致腐菌小新壳梭孢菌FJAT-3531的抑菌活性与伊枯草菌素含量、丰原素含量及总脂肽含量间相关系数分别为0.7678**、0.7351**和0.7625**，均呈极显著正相关（P<0.01），而与表面活性素含量相关系数为0.3759，两者间相关性不显著（P>0.05），表明菌株FJAT-3531粗脂肽中发挥抑菌作用的活性成分可能为伊枯草菌素和丰原素。

3 结论与讨论

脂肽是由非核糖体途径合成，不同菌株所产脂肽组分不一样，但同一菌株在不同的培养条件下所产脂肽组分和含量也会有所不同。李兴玉等[7]报道枯草芽胞杆菌XF1菌株在5种不同的培养基发酵液中所含环脂肽类化合物色谱图基本一致，但脂肽产量最高者为最低者的2.94倍。张晓云等[8]分析了不同碳、氮源对枯草芽胞杆菌BAB-1菌株脂肽产量的影响，结果表明，熊果苷是BAB-1菌株产生表面活性素的最佳碳源，其含量是L阿拉伯糖的5.60倍;熊果苷与葡萄糖利于该菌株产生丰原素，显著高于D木糖、D核糖及L阿拉伯糖。本研究结果显示，贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028在12种培养基中所产的脂肽组分均含有伊枯草菌素、丰原素、表面活性素，但各组分的含量均不同，且差异显著。

金属离子对抑菌脂肽的产生有一定影响，铁、镁、锰离子能促进抑菌脂肽的产生。刘宇帅等[9]研究表明，较高浓度的葡萄糖和无机盐及较低浓度的Mg2+能够显著提高解淀粉芽胞杆菌TF28抑菌脂肽的产量;黄翔峰等[10]研究发现，添加Fe2+能大幅提高脂肽产量。本研究发现，FJAT-45028菌株在加入Mg2+和Fe2+的F和K培养基产生的脂肽含量显著高于未添加Mg2+和Fe2+的A和B培养基，其中F发酵液中脂肽含量为B培养基的23.8倍，说明Mg2+和Fe2+也能促进FJAT-45028菌株的脂肽的合成。

研究表明，丰原素和伊枯草菌素具有与化学农药相当的生物活性，能显著抑制植物病原真菌的生长。付瑞敏等[3]研究发现，解淀粉芽胞杆菌BA168产生的丰原素是抑制苹果采后病害扩展青霉病原菌的脂肽成分;Calvo等[11]研究表明，解淀粉芽胞杆菌BUZ14脂肽伊枯草菌素A是防控桃子褐腐病和苹果蓝腐病的主要抑菌成分;蒋梦曦等[12]用脂肽伊枯草菌素A处理樱桃番茄后，腐烂率可降低55%;朱弘元等[13]研究发现，解淀粉芽胞杆菌B15生产的伊枯草菌素A、丰原素对葡萄灰霉病菌有较好的抑菌效果。本研究结果显示，菌株FJAT-45028粗脂肽对龙眼致腐菌小新壳梭孢菌的抑制活性与伊枯草菌素和丰原素呈极显著正相关，表明粗脂肽发挥抑菌作用的活性组分可能为伊枯草菌素和丰原素，该结果与前人报道相吻合。综合考虑脂肽产量和抑菌活性，贝莱斯芽胞杆菌FJAT-45028产脂肽的最佳培养基配方为蔗糖20 g·L-1、酵母浸膏20 g·L-1、牛肉浸膏15 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.6 g·L-1、FeSO4·7H2O 9.0 mg·L-1。本研究结果为脂肽在龙眼采后病害防控的应用奠定基础。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-10-12

作者简介：陈燕萍，女，1985年生，硕士，助理研究员，主要从事生物防治研究。

通信作者：王阶平，男，1972年生，博士，研究员，主要从事微生物生物技术与农业生物药物（E-mail：781063449@qq.com）。

基金项目：福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项（2019R1034-5、2019R1034-2）;福建省农业科学院对外合作项目（DEC2020-06）。