乌江流域某水库浮游藻类群落结构及多样性分析

岳一鸿, 傅志伟, 陈学萍, 杨 明, 王宝利, 汪福顺

(1.上海大学环境与化学工程学院, 上海 200444;2.天津大学表层地球系统科学研究院, 天津 300072)

乌江(东经105°09′ ∼109°26′, 北纬25°56′ ∼30°01′)位于中国云贵高原东部和四川盆地南缘, 流经贵州省北部和重庆市东南部, 在涪陵注入长江, 是贵州省境内最大的河流, 也是长江上游南岸最大的支流.乌江流域作为我国水能资源的“富矿区”, 因其径流量和天然落差都相对较大, 其梯级开发是国家优先考虑的流域开发系统工程之一[1-2].目前, 在乌江流域建成并投入使用的水库主要有红枫湖水库(1960 年)、百花湖水库(1966 年)、修文水库(1967 年)、窄巷口水库(1970 年)、红岩水库(1974 年)、乌江渡水库(1979 年)、东风水库(1994 年)、普定水库(1994年)、索风营水库(2003 年)、引子渡水库(2003 年)、洪家渡水库(2003 年)等[3-4].这些梯级水库群已成为我国梯级水库系统的典型代表.

梯级水库在为人类提供大量水电能源的同时, 不可避免地改变了流域原有的生态环境.在梯级开发形成水库的过程中, 由于库区水位的上升、水流速度的减缓、水体透光性的改变以及自净能力的减弱、营养盐的积累、水库的泄洪等因素的改变, 导致水体中原有藻类的种类、数量和分布发生显著性变化[5].浮游藻类是水生生态系统中主要的初级生产者[6], 包括蓝藻、绿藻、硅藻、金藻、甲藻、黄藻、裸藻和隐藻共8 个门[7].浮游藻类的种类组成、群落结构和丰度变化, 可直接影响水体水质、系统内能量流、物质流和生物资源变动[8-10].因而, 浮游藻类的研究对于水域生态系统的认识具有重要的作用, 被认为是所属水域自然环境及生态环境变化的晴雨表.

近年来, 随着分子生物学技术的发展, 凭借着成本低、通量高、流程自动化等优势, 高通量测序技术为开展浮游藻类群落结构多样性研究提供了新的技术平台[11-14].目前, 分子标记被用于扩增编码核糖体保守基因的可变区, 进而基于高通量测序技术的DNA 宏条形码研究, 使得对环境样品中生物多样性及复杂群落结构的评估成为可能.本研究利用两对分子标记A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR, 对乌江流域某水库不同深度采样点的水样扩增浮游藻类基因的保守区段, 利用高通量测序技术注释得到的23 rRNA 基因片段可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)结果, 比较所获得的浮游藻类的覆盖度来选择相对高效的分子标记, 为进一步开展乌江流域不同梯级水库中浮游藻类的种群多样性研究提供参考和借鉴.

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

采样时间是2017 年1 月.首先, 利用分层采水器在乌江流域某水库水下0, 10 和45 m 深度采集水样; 然后, 使用直径47 mm、孔径0.22 µm 的无菌醋酸纤维滤膜(Whatman, 德国)在砂芯过滤装置上正压过滤500 mL 水样; 最后, 将过滤后的滤膜—20°C 保存, 随后放置在实验室—80°C 冰箱冻存.

1.2 DNA 抽提及聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增

使用Fast DNA SPIN Kit for Soil 试剂盒(MP, 美国)抽提水样中的基因组DNA.以基因组DNA 为模板, TransStart Fastpfu DNA Polymerase 为扩增酶, 利用PCR 仪(ABI GeneAmp®9700 型)进行PCR 扩增,对待测序区域进行富集,其中A23SrV1F/A23SrV1R(一轮)/A23SrV2F/A23SrV2R(二轮)PCR 反应的条件为: 95°C 变性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共30 个循环; 最后72°C 延伸10 min[15].p23SrVF/p23SrVR PCR 反应的条件为: 95°C 变性3 min, 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s, 共35 个循环; 最后72°C 延伸10 min[16].表1 为实验所用的测序引物.

表1 实验所用的测序引物Table 1 Sequencing primers used for test

配制质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物, 并对PCR 产物进行胶回收纯化;纯化后用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega, 美国)进行定量检测, 并按照每个样品的测序量要求构建高通量测序文库.使用Illumina HiSeq 2500 平台对文库进行测序.

1.3 数据处理与分析

在数据质控处理中, 过滤出尾部质量值小于20 的碱基; 根据双端(paired-end, PE)读长(reads) 之间的重叠(overlap) 关系, 将成对reads 拼接成一条序列, 最小overlap 长度为10 bp, 并筛选掉拼接序列的overlap 区错配比率大于0.2 的序列; 根据序列首尾两端的条形码(barcode)将嵌合体序列去除, 并调整序列方向, 然后按照阈(cut off)值将相似性高于97% 的高质量序列进行操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)的划分.将所测得的基因序列通过Blast (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/blast.cg) 在Genbank 中进行相似序列搜索比对.

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增产物

不同样品的PCR 扩增结果如图1 所示.可以看出, 所扩增的目的片段条带单一, 片段大小约为410 bp.每个样品重复3 次, 不同样品的电泳条带亮度较为一致.

图1 不同水深样品中两对引物扩增的PCR 产物电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products amplified from the samples at different water depth

2.2 测序深度与饱和度

对测序原始序列剔除原核但保留蓝细菌门后, 引物A23SrV2F/A23SrV2R 共获得高质量序列99 070 条, 其中深度0 m 样品的序列数为35 791 条, 深度10 m 样品的序列数为28 881条, 深度45 m 样品的序列数为34 398 条.同样, 引物p23SrVF/p23SrVR 共获得高质量序列103 420 条, 其中深度0 m样品的序列数为28 954 条, 深度10 m 样品的序列数为32 662 条, 深度45 m 样品的序列数为41 804 条.

对测序序列进行随机抽样, 以抽到的序列数与其代表的OTU 数目构建稀释性曲线, 结果如图2 所示.可以看出, 每个样品的稀释性曲线趋于平坦, 表明测序量合理, 测序深度已达到反应样品中所有OTU 数量的标准, 测序结果在深度2 000 reads 时能够真实反映样品中藻类的数量关系.引物A23SrV2F/A23SrV2R 深度0 m 样品序列注释为101 种浮游藻类的OTU,深度10 m 样品序列注释为84 种浮游藻类的OTU, 深度45 m 样品序列注释为98 种浮游藻类的OTU(见图2(a)).而引物p23SrVF/p23SrVR 深度0 m样品序列注释为172 种浮游藻类的OTU, 深度10 m 样品序列注释为140 种浮游藻类的OTU, 深度45 m 样品序列注释为236 种浮游藻类的OTU(见图2(b)).

图2 不同样品在97%相似性水平下的稀释曲线Fig.2 Rarefaction curves of different samples at the 97% similarity level

2.3 多样性指数分析

对两对引物的3 个采样点分析选取生态学中的评估指数, 具体如表2 所示.Coverage 是测序深度指数, 表示各样品文库的覆盖率, 其数值越高, 则样本中序列没有被测出的概率越低.本次的采样点Coverage 均在0.999 以上, 说明本次测序结果可以代表样本的真实情况.在对3 个采样点进行丰富度分析中, 采用ACE 指数和Chao 指数, 二者是估算样品中浮游藻类丰度的指数, 主要用来估计群落中含有的OTU 数目.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3 个采样点的ACE 指数是86∼108, Chao 指数是85∼106, 其中10 m 采样点种类数最少, 为85种, 0 m采样点种类数最多, 为108 种; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3 个采样点的ACE 指数是153∼236, Chao 指数是157∼237, 其中10 m 采样点种类数最少, 为153 种, 45 m 采样点种类数最多, 为237 种.在对3 个采样点进行多样性指数分析中, 采用Shannon 指数和Simpson 指数, 二者是常用的反映α 多样性的指数, 用于估算样品中浮游藻类多样性的指数, Simpson 指数值越大, 说明群落多样性越低; Shannon 值越大, 说明各种个体分配越均匀, 群落多样性越高.在A23SrV2F/A23SrV2R 中, 3个采样点的Simpson 指数是0.082∼0.111, Shannon 指数是2.73∼2.97, 表明3 个采样点样品间OTUs 数目的分布差异不大; 在p23SrVF/p23SrVR 中, 3个采样点的Simpson 指数是0.05∼0.116, Shannon 指数是2.82∼3.62, 表明3 个采样点样品间OTUs 数目的分布差异较大.

表2 两对引物扩增产物不同采样点的多样性指数比较Table 2 Comparisons of diversity indices in different samples between two pairs of primers

2.4 浮游藻类群落组成分析

对得到的OTUs 序列进行物种注释, 两对引物分别扩增的3 个不同深度采样点均涵盖5 门11 属, 如图3 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物扩增的0, 10 和45 m样品中, 绿藻门(Chlorophyta)占总种类数的比例分别为22.7%, 25.1%和30.8%, 蓝藻门(Cyanobacteria)占总种类数的比例分别为17.2%, 42.2%和7.77%, 硅藻门(Bacillariophyta)占总种类数的比例分别为18.3%, 7.30% 和1.06%, 不等鞭藻门(Heterokonta)占总种类数的比例分别为1.40%,0.42%和0.81% (见图3(a)).在p23SrVF/p23SrVR 引物扩增的0, 10 和45 m 样品中, 绿藻门(Chlorophyta)占总种类数的比例分别为16.7%, 16.6%和36.7%, 蓝藻门(Cyanobacteria)占总种类数的比例分别为23.1%, 51.7%和3.68%, 硅藻门(Bacillariophyta)占总种类数的比例分别为15.1%, 6.34% 和1.63%, 不等鞭藻门(Heterokonta)占总种类数的比例分别为0.95%,0.47% 和2.99% (见图3(b)).

图3 各采样点浮游藻类门类和属类组成百分比Fig.3 Percentage of different phyla and genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes

在高通量测序结果中, 两个引物在群落组成上存在相同点, A23SrV2F/A23SrV2R 和p23SrVF/p23SrVR 引物扩增的样品(见表3)中, 10 m 均以蓝藻为优势类群, 45 m 均以绿藻门为优势类群, 而0 m 采样点主要以绿藻门、蓝藻门和硅藻门为主, 没有明显的优势类群.同时, 两个引物在3 个采样点占优势类群的核心OTU 略有不同, A23SrV2F/A23SrV2R引物和p23SrVF/p23SrVR 引物扩增(见表4)中, 0 和45 m 的核心OTU 是拟多甲藻属(Peridiniopsis)(见图3(c)), 而10 m 的核心OTU 是聚球藻属(Synechococcus)(见图3(d)).

表3 各采样点浮游藻类门类组成百分比Table 3 Percentage of different phyla of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %

表4 各采样点浮游藻类属类组成百分比Table 4 Percentage of different genera of phytoplankton in different samples identified by two degenerate primes %

2.5 样品OTU 分布Venn 图分析

为了较为直观地比较3 个不同水深采样点之间OTU 组成的相似程度, 在97% 相似度水平上以OTU 为单位做成维恩(Venn)图, 结果如图4 所示.在A23SrV2F/A23SrV2R 引物扩增的0,10 和45 m 样品(见图4(a))中,独有的OTU 分别为7,1 和5 个,3 个采样点共有的OTU为23 个, 占全部的40.35%; 而在p23SrVF/p23SrVR 引物扩增的0, 10 和45 m 样品中(见图4(b)), 独有的OTU 分别为6, 3 和28 个, 3 个采样点共有的OTU 为34 个, 占全部的36.56%.

图4 各采样点浮游藻类OTU 分布的Venn 图Fig.4 Venn diagrams of OUT distribution in different samples identified by two degenerate primes

3 讨 论

乌江作为长江上游南岸最大的支流, 其流域是典型的喀斯特地貌.随着乌江梯级水库的开发和建立, 乌江流域整个库区的生态环境都产生了重大影响.近些年, 国内对乌江梯级开发后浮游植物丰度和群落结构的变化都开展了采样研究.王崇等[17]在2007 年7 月和10 月对乌江流域的浮游植物种类组成、数量变化特征及与水环境因子的相关性进行调查, 共鉴定出浮游植物计7 门75 属156 种, 包括硅藻门、绿藻门、蓝藻门、裸藻门、甲藻门、隐藻门和金藻门, 其中硅藻门为优势物种, 占检出种类的43.6%; 绿藻门和蓝藻门次之, 分别占检出种类的35.3%和14.1%.任启飞等[18]在2008 年8 月到2009 年9 月对红枫湖水库浮游植物进行14 个月的定点逐月调查, 共检测到浮游植物72 属, 分属8 门, 其中绿藻门为优势物种, 占总种类的54.2%,蓝藻门和硅藻门分别占总种类数的19.9% 和15.9%, 同时也观察到了金藻门、甲藻门、隐藻门、裸藻门和黄藻门.王叁等[19]于2008 年8 月至2009 年7 月对百花湖水库的浮游植物进行采样调查, 镜检结果共检测到浮游植物7 门81 属, 主要以绿藻门、蓝藻门和硅藻门为主, 分别占41% 、25%和22%.本研究通过高通量测序技术, 共鉴定出浮游藻类5 门11 属, 两对引物扩增的3 个采样点(0, 10 和45 m)的浮游植物主要由蓝藻门、绿藻门和硅藻门组成.这与之前对乌江流域浮游植物的研究结果相符.两对不同引物扩增的10 和45 m 样品中, 优势群落均为蓝藻和绿藻, 但两对引物扩增的0 m 样品中, 绿藻、硅藻和蓝藻三者差别不大.浮游藻类的生长繁殖与自身的生物特性及CO2、光照、温度和营养盐等环境因子相关, 这可能是引起不同采样点优势藻类出现差异的原因.

浮游藻类多样性的研究方法有多种, 在对乌江流域浮游藻类的群落分布进行研究时, 多以传统镜检为主, 即借助显微镜观察藻类细胞的形态以确定种类.镜检方法工作量大, 主观性强,并对仪器的分辨率要求很高.武秀国等[20]2013 年4∼9 月对3 种养殖类型池塘的藻类群落结构进行了镜检分析, 共镜检出藻类7 门58 种.施择等[21]于2012 年5 月和12 月对滇池浮游藻类群落构成进行了调查, 共镜检出浮游藻类8 门66 属159 种.本研究中鉴定出的浮游藻类中,不等鞭藻门是乌江流域采样点从未检出过的, 表明相对于传统镜检的方法, 高通量测序技术可监测到显微镜镜检方法检测不到的生物物种, 可弥补光学显微镜观察结果的不足.

4 结束语

从20 世纪80 年代以来, 乌江流域在梯级水库蓄水后生态环境发生了改变, 水体自净能力的降低曾导致水华现象频发.针对水体浮游藻类鉴定方法中存在的难题, 本研究利用已报道的两对藻类简并引物, 借助高通量测序平台对3 个不同水深水层中浮游藻类的多样性开展研究,为乌江流域不同梯级水库中浮游藻类多样性的研究提供了一种高效的检测方法.