带固相萃取功能索氏提取装置提取紫苏挥发性成分的方法分析

许 永，黄海涛，李 晶，刘 欣，王 晋，杨叶昆，孔维松

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明 650106）

紫苏（Perilla frutescens）是唇形科一年生草本自花授粉植物，具有特异芳香［1］，在医药、食品等领域有重要的开发价值［2］。紫苏具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗艾滋病等多种生理活性［3，4］。紫苏挥发油是紫苏叶的主要活性成分，含紫苏醛、紫苏酮等成分，已广泛用于食品、皂用香精及化妆品加香，在烟草中加入紫苏配方可改善烟草的吸味、增加烟草甜香，改善干、涩、苦口感，满足消费者要求。紫苏叶是制备芳香挥发油的主要器官部分［5］，近年来，紫苏叶挥发性成分也已成为食品、医疗等领域研究的热点之一。因此，研究紫苏叶的挥发性成分具有重要意义。

紫苏挥发物提取多采用水蒸气蒸馏法［6-8］、同时蒸馏萃取法［9］、超临界 CO2提取法［10，11］、固相微萃取［12，13］、吹扫捕集［14］等方法，多数采用气相色谱质谱［7，14］对挥发物组成进行测定，有的也采用电子鼻［15］、全二维气相色谱-飞行时间质谱［16］等。水蒸气蒸馏提取法和超临界CO2提取法二者都存在样品用量大、费时及提取成本高等缺点，同时蒸馏萃取可导致某些欠稳定组分长期和热水反应分解，造成小分子挥发物损失，结果重现性差。固相微萃取法和吹扫捕集无需溶剂与前处理，从样品中直接采集挥发性成分，能更好地体现被检测挥发物的真实组成［17］，但重现性较差。溶剂萃取法操作简单、经济实用、提取效率高。对固体物质的萃取通常采用冷浸法或热浸法（索氏提取器），冷浸法是靠溶剂长时间的浸润溶解从而将溶剂中的可溶物质浸提出来；热浸法是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质被纯溶剂持续提取，但在提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，影响分析结果，而且在提取过程中很难避免挥发性成分损失。

现有的方法均无法满足紫苏挥发性及半挥发性成分准确分析和客观评价的要求。本研究对样品前处理方法进行改进，设计了如图1所示的带固相萃取功能的索氏提取装置，该装置于密闭环境进行加热萃取，集萃取、净化和浓缩为一体，中途不需要转移样品，大大简化了样品前处理操作，有效缩短了样品前处理周期。该方法的建立为紫苏挥发性及半挥发性成分提供了快速、可靠的分析方法，为紫苏叶精油质量控制提供参考，并可对卷烟生产企业日常调香工作的开展起参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：紫苏叶原料购自云南鸿翔一心堂药业（集团）股份有限公司。

仪器：高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；Agilent 6890-5973N气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；ME414S型电子天平，德国Sarto⁃rius公司，感量0.000 1 g；自主研发的带固相萃取功能的索氏提取装置（图1）。

试剂：二氯甲烷，色谱纯，美国Dicma公司；柱色谱硅胶，200～300目，青岛海洋化工厂；无水硫酸钠，AR，天津化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

1）紫苏叶样品处理。将购买的紫苏叶经高速万能粉碎机粉碎，过孔径为450 μm的标准检验筛，得均匀粉末。

2）样品提取。在固相萃取柱中加入10 g硅胶（200～300目），称取20 g紫苏叶样品于样品筒中，在样品上方覆盖一层无水硫酸钠后，夹紧密封，将色谱进样瓶与圆底烧瓶的螺纹接口密封连接，并在烧瓶中加入200 mL二氯甲烷溶剂，然后将烧瓶置于水浴锅中，50℃加热，冷凝回流3 h后，切换三通阀，使其与外界空气导通，不断挥发的溶剂通过三通阀流出并回收，达到浓缩的目的，当色谱进样瓶中的样品溶液蒸发至约1 mL后，旋下色谱进样瓶即可进行GC-MS分析。

1.2.2 气相色谱条件 DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样量 1.0 μL；柱流量 1.0 mL/min；分流比 10∶1；进样口温度 260℃；程序升温条件：50℃保持 2 min再以 5℃/min升至 220℃，再以10℃/min升至250℃，保持10 min。

1.2.3 质谱条件 电子轰击离子源E1；离子化电离能70 eV；离子源温度230℃；传输线温度280℃；质量扫描范围 50～350 amu；WILEY、NIST 谱库进行检索。

2 结果与分析

2.1 带固相萃取功能的索氏提取装置设计及工作原理

样品前处理装置结构见图1。工作原理：启动水浴锅加热，溶剂蒸发后经密闭冷凝管冷凝回流到样品筒中，溶剂先经无水硫酸钠层干燥，然后对样品进行提取，提取液经过硅胶柱净化后回流至烧瓶中。经过一段时间的回流提取后，调整三通阀与外界空气导通，不断挥发的溶剂通过三通阀流出并回收，此时烧瓶中的溶液不断被浓缩，当浓缩至约1 mL时停止加热，卸下色谱进样瓶即可进行分析。

带固相萃取功能的索氏提取装置可在密闭条件下对样品进行分离、提纯、浓缩，无需多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率。此外，本装置采用全封闭的冷凝管，有效避免了提取溶剂的挥发损失，大大降低了样品前处理过程对实验室环境造成的污染，密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免因压力过高对提取装置造成的损坏；装置在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需转移样品。装置还设计了连接色谱进样瓶接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下色谱进样瓶即可直接进行分析，避免常规样品尾管浓缩烧瓶浓缩完后，需用吸管将尾管中的溶液取出并洗涤尾管和吸管的步骤，进一步简化了样品前处理操作。

2.2 样品前处理条件的确定

2.2.1 提取试剂优化 采用本研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置提取紫苏样品，分别用正己烷和二氯甲烷进行提取，分析对比提取液GC-MS总离子流。结果表明，2种提取试剂中，二氯甲烷溶剂萃取得到的化学成分种类更多，色谱峰面积较大，故选用二氯甲烷作为提取溶剂。

2.2.2 提取时间优化 按照样品前处理方法，采用本研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置分别提取紫苏样品 1、2、3、4、5 h，分析对比不同提取时间得到的提取液GC-MS总离子流。结果表明，提取3 h后，总离子流中化学成分种类及色谱峰面积基本保持不变，为保证目标物提取完全，选择提取时间为3 h。

2.2.3 固相萃取填料用量优化 索氏提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，因此本研究对传统索氏提取装置进行了改进，于索氏提取装置中增设了固相萃取柱，采用硅胶作为固相萃取填料吸附提取液中的杂质，并对硅胶用量进行优化。在固相萃取柱中分别加入 5、10、20、30 g硅胶颗粒（200～300目），在样品筒中加入20 g紫苏样品，以二氯甲烷为提取溶剂，50℃加热，冷凝回流3 h，分析对比提取液GC-MS总离子流。结果表明，硅胶用量为5 g时，提取液总离子流中化学成分种类较多，经检索后各物质匹配度均不高，且色谱峰面积明显小于另外3种硅胶用量，可能是由于硅胶用量较少，没有达到明显的净化效果；硅胶用量为10和20 g时，提取液总离子流中化学成分种类及色谱峰面积没有明显变化；硅胶用量为30 g时，提取液总离子流中化学成分种类及色谱峰面积略低于10和20 g的硅胶用量，可能是由于硅胶用量较大时吸附了部分挥发性成分。为了实现提取液的有效净化，选择10 g硅胶作为填充量。

2.3 紫苏挥发性成分分析

紫苏提取液进行GC-MS分析，相应的质谱总离子流如图2所示，挥发性成分用WILEY、NIST谱库进行检索，相对含量利用峰面积归一法进行计算。以二氯甲烷为溶剂，采用自制的带固相萃取功能的索氏提取装置从紫苏叶中提取挥发性成分，经GCMS分析，共鉴定出75种挥发性物质，主要包括烯烃类、醇类、酮类等（表1）。由表1可以看出，检出烯烃类化合物最多（28种），总含量为14.63%，含量较高的成分主要有石竹烯（8.38%）、Z，E-α-法尼烯（1.40%）、律草烯（1.19%）、1，3-二异丙基-1，3-环戊二烯（1.01%）等；醇类化合物次之（13种，含量4.90%），含量最高的成分是芳樟醇（1.94%）；酮类化合物有12种，含量高达65.75%，含量较高的成分主要有紫苏酮（56.16%）、异脱氢紫苏酮（8.11%）等；有机酸有4种，含量为1.87%，含量最高的成分是棕榈酸（1.41%）；其他还有少量酚类化合物（2种）、醛类化合物（3种）、酯类化合物（3种）、醚类化合物（1种）、烷烃类物质（3种）、其他物质（6种）等。

图2 紫苏挥发性化学成分总离子流

从表1中还可以看出，从紫苏叶提取物中得到45种香味成分，占挥发性物质相对含量的88.66%。这些香味成分协调配伍，赋予了紫苏特殊的香气。

紫苏提取物中部分挥发性物质还具有一定的药用活性，如含量最高的紫苏酮不仅具有特异的芳香气味，还能通过干扰细菌的代谢达到抗菌抑菌效果，同时还能增加小肠推进力起到解鱼蟹毒的作用［18］；紫苏醛具有独特的药用效果，如抗衰老、降血脂、抗过敏炎症等功能；子丁香酚具有抗菌、健胃、降血压的作用；D-柠檬烯作为特征香气成分之一，不仅能

广泛应用于食用香精中，还能通过抑制蛋白质异戊烯化来预防和抑制肿瘤的发生，具有抗癌作用；芳樟醇具有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药理活性［19］；榄香烯是一种抗癌成分，用于治疗脑癌、肺癌和消化道肿瘤等［20］；洋芹醚有催眠、镇静和抑菌作用［21］；石竹烯广泛应用于食品香料方面，同时还兼备祛痰止咳、消毒杀菌的药用价值，是治疗老年支气管炎的有效成分［22］。

表1 紫苏挥发性化学成分分析结果

续表1

续表1

2.4 方法重复性

为了考察该方法的精密度，对紫苏样品进行了7次日内重复测定，同时进行了7 d的重复性试验，选取紫苏酮、石竹烯、异脱氢紫苏酮、石竹烯氧化物、棕榈酸、芳樟醇作为标记物，考察重复性，结果见表2，日内测定的相对标准偏差为2.5%～4.3%，日间测定的相对标准偏差在2.8%～4.8%，测定结果具有很好的重现性，表明该方法的日内和日间精密度较好。

3 结论

针对目前索氏提取前处理操作复杂、萃取过程大量杂质会随挥发性成分一起溶出影响检测等问题，本研究设计开发了一种新型的集提取、净化、浓缩及转移功能为一体的带固相萃取功能索氏提取装置，中途不用转移样品，密闭环境进行加热萃取，大大简化了样品前处理操作，有效缩短了样品前处理周期，为紫苏挥发性及半挥发性成分提供了快速、可靠的分析方法。

表2 方法重复性试验结果（n=7）

利用自主设计的带固相萃取功能的索氏提取装置提取紫苏中的挥发性成分，采用GC/MS联用技术分析鉴定出75种挥发性组分，其中具有香味的成分有45种，这些成分具有的特征香气，可用于香精、香料及制药，具有很高的开发利用价值。