长链非编码RNA XLOC-013014在肾癌组织中的表达及对肾癌细胞恶性生物学行为的影响

潘 良,王宇雄,卞亭长,郦俊生,林文耀

(上海市徐汇区中心医院泌尿外科,上海 200030;*通讯作者,E-mail:phmolon@163.com)

肾癌是最常见的肾原发性恶性肿瘤,进展较快、恶性程度较高、预后较差,严重威胁人类生命和健康[1]。肾癌的具体发病机制尚不清楚,研究肾癌发生发展的分子机制,寻找早期诊断标志物和治疗靶点具有重要临床意义。人类基因组中的大部分转录产物均为非编码RNA,其中长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lnc-RNA)是非编码RNA的重要组成部分[2]。近年来,研究表明lncRNA可参与多种疾病包括肿瘤的发生、发展,与肿瘤的恶性生物学行为如增殖、迁移、凋亡、分化等相关[3]。lncRNA在肾癌中的作用日益受到关注[4]。XLOC-013014作为lncRNA家族的重要成员,长度为494个核苷酸,属于基因内lncRNA,其在肿瘤特别是肾癌中所起的作用及下游分子通路有待进一步阐明。本研究旨在观察XLOC-013014在肾癌组织和细胞中的表达,并通过转染XLOC-013014质粒至肾癌细胞,探究XLOC-013014对肾癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

37例肾癌组织和癌旁组织来源于2016年11月至2018年10月上海市徐汇区中心医院泌尿外科手术切除的标本,保存于液氮中。患者术前均未接受过放化疗,标本均经两位以上病理专家确认,37例肾癌组织均为肾透明细胞癌。本研究经本院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。肾癌细胞株(CaKi-1、786-O、A498、ACHN)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)购自武汉典型培养物保藏中心,细胞均采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养,培养条件为37 ℃、5%CO2。DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。逆转录试剂盒和荧光实时定量聚合酶链反应(qPCR)试剂盒购自美国Fermentas公司。含有XLOC-013014全长的质粒和对照质粒购自上海捷瑞生物科技有限公司。转染试剂LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。一抗β-微管蛋白(β-Tubulin)、Kruppel样转录因子2(KLF2)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、蛋白激酶B(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)购自美国BD公司。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞转染 将A498细胞接种6孔板,随机分为对照组和实验组,分别转染对照质粒和含有XLOC-013014全长的质粒。当细胞汇合度达到70%融合时,根据LipofectamineTM2000 Reagent说明书通过瞬时转染技术将脂质体和转染质粒稀释,稀释液混匀静置15 min,分别滴加至6孔板。转染24 h后更换为新鲜培养基。

1.2.2 生物信息学预测靶基因 采用LncBase Predicted v.2在线预测软件预测XLOC-013014的靶miRNA,采用TargetScan Release 3.1在线预测软件预测相应miRNA的靶基因。

1.2.3 qPCR检测XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表达 采用Trizol试剂提取肾癌组织和细胞中总RNA,反转录为cDNA作为模板。以GAPDH或U6为内参,分别检测XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表达。根据qPCR试剂盒说明进行操作,反应条件为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环,特异性引物序列见表1。

表1 qPCR特异性引物序列

1.2.4 Western blotting检测KLF2蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白表达 A498细胞转染48 h后,PBS溶液反复洗涤细胞3次,细胞裂解液在冰上裂解提取细胞总蛋白,每组取60 μg总蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离后,半干法转印至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶室温下封闭1 h。5%脱脂牛奶稀释一抗(p-AKT、KLF2、p-mTOR、AKT、mTOR)和山羊抗兔二抗,一抗按1∶1 000进行稀释,4 ℃孵育过夜。山羊抗兔二抗按1∶5 000进行稀释,室温下孵育1 h,洗膜后采用化学发光法曝光显影,比较各组蛋白表达量。

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖 A498细胞转染48 h后,胰酶消化并使用无血清培养基制备单细胞悬液,分别以每孔4×103个细胞密度接种于96孔板,连续培养并检测5 d。在每天相同时间点,每孔分别加入20 μl CCK-8溶液,培养4 h后,采用酶标仪读取每孔在490 nm处的吸光度值。以时间为横坐标,以吸光度值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移 A498细胞转染48 h后,胰酶消化并使用无血清培养基制备单细胞悬液,将细胞密度调整为3×105个/ml,取每组200 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室中,下室加入含10%胎牛血清的培养基600 μl,培养箱培养24 h。取出小室,采用甲醇固定30 min,采用结晶紫溶液染色30 min,PBS溶液冲洗。待小室基底膜风干后,每组在倒置显微镜下选取4个视野拍照并计数,取平均值比较不同组A498细胞迁移能力。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肾癌组织和癌旁组织中XLOC-013014的表达

XLOC-013014在肾癌组织和癌旁组织中的相对表达分别为1.08±0.32和4.07±0.57,XLOC-013014在肾癌组织中的相对表达显著少于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01,见图1)。

与癌旁组织相比,**P<0.01

2.2 肾癌细胞株中XLOC-013014的表达

XLOC-013014在肾癌细胞株(CaKi-1、786-O、A498、ACHN)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)中的相对表达分别为0.80±0.02,0.34±0.03,0.11±0.01,0.62±0.04和1.00±0.05,XLOC-013014在肾癌细胞株中的相对表达均少于正常肾小管上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.01),在A498细胞中的相对表达最低(P<0.01,见图2)。

与HK-2相比,**P<0.01

2.3 生物信息学预测XLOC-013014的靶基因

采用LncBase Predicted v.2在线预测软件预测XLOC-013014的靶基因是miR-342-3p,采用TargetScan Release 3.1在线预测软件预测miR-342-3p的靶基因是KLF2(见图3)。

图3 生物信息学预测XLOC-013014的靶基因

2.4 两组A498细胞中XLOC-013014、miR-342-3p和KLF2 mRNA的表达

对照组和实验组A498细胞中XLOC-013014的相对表达分别为1.02±0.11和12.61±1.17,实验组中XLOC-013014的相对表达显著增加(P<0.01)。对照组和实验组A498细胞中miR-342-3p的相对表达分别为1.00±0.04和0.24±0.06,实验组中miR-342-3p的相对表达显著减少(P<0.01)。对照组和实验组A498细胞中KLF2 mRNA的相对表达分别为1.47±0.75和6.68±0.98,实验组中KLF2 mRNA的相对表达显著增加(P<0.01)。

2.5 KLF2和PI3K/AKT信号通路蛋白表达变化

对2.4中成功转染XLOC-013014质粒的细胞系进行Western blotting检测,细胞中KLF2蛋白表达升高,PI3K/AKT信号通路蛋白如p-AKT、p-mTOR表达降低,AKT、mTOR蛋白表达无明显差异(见图4)。

图4 Western blotting检测两组细胞中KLF2蛋白及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达

2.6 XLOC-013014对肾癌A498细胞增殖的影响

CCK-8法检测两组A498细胞的增殖能力,酶标仪检测并绘制生长曲线。结果显示,与对照组相比,实验组A498细胞由第3天开始,细胞生长速度显著减慢,差异有统计学意义(P<0.05,见图5),提示XLOC-013014可以抑制A498细胞的增殖能力。

与对照组相比,*P<0.05

2.7 XLOC-013014对肾癌A498细胞迁移能力的影响

Transwell实验检测两组A498细胞的迁移能力,对照组和实验组A498细胞在24 h的穿膜细胞数分别为(153.60±20.34)个和(81.79±13.55)个,实验组A498细胞迁移能力显著少于对照组(P<0.05,见图6),提示XLOC-013014可抑制A498细胞的迁移能力。

与对照组相比,*P<0.05

3 讨论

长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)由于不具有编码蛋白的功能,起初被认为不具有生物学功能,只是基因组转录产生的“噪音”[5]。近年来的研究表明,lncRNA可在众多层面如表观遗传水平、转录水平、转录后水平调控基因的表达,参与疾病包括肿瘤的发生、发展。lncRNA的异常表达与肿瘤的进展、转移、防治、预后等密切联系[6]。研究显示,TP73-AS1[7]、ENSG00000241684[8]、FENDRR[9]、HOTTIP[10]等多条lncRNA在肾癌中异常表达,参与调控肾癌的恶性生物学行为,在肾癌发生发展中发挥至关重要的作用。XLOC-013014是真正意义的lncRNA,由于缺乏开放阅读框,XLOC-013014无法作为编码蛋白的模板,其在肾癌中的表达及其对肾癌细胞增殖、迁移的影响,目前尚无研究报道。本研究通过qPCR检测肾癌组织和细胞中XLOC-013014的表达,发现XLOC-013014在肾癌组织和细胞中表达显著降低,提示XLOC-013014可能成为一种新型的肾癌诊断标志物。在肾癌细胞系A498中,通过瞬时转染技术转入含有XLOC-013014全长的质粒,可显著提高A498细胞中XLOC-013014的表达。

多项研究表明,LncRNA可通过“海绵样”方式结合并下调多种miRNA的活性,进而调控miRNA靶基因的表达,介导肿瘤的表观遗传调控[5,11]。采用LncBase Predicted v.2在线预测软件预测XLOC-013014的靶基因是miR-342-3p。通过高表达A498中XLOC-013014的表达,发现XLOC-013014表达增加后,miR-342-3p表达降低,XLOC-013014可能具有吸附并降低miR-342-3p表达的作用。采用TargetScan Release 3.1在线预测软件预测miR-342-3p的靶基因是Kruppel样转录因子2(KLF2)。KLF2基因定位于染色体10p13.1,由1 655个碱基组成[12]。KLF2蛋白作为KLF家族中重要的转录因子,由354个氨基酸组成,参与调控血管张力、血管形成、血管新生等重要过程,在维持血管稳态方面发挥重要[13,14]。近年来,KLF2在恶性肿瘤中的调控作用受到广泛关注。KLF2在多种恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌中表达降低,发挥显著的抗肿瘤作用[15-17]。本研究发现,miR-342-3p表达降低可显著升高KLF2的表达,miR-342-3p可能对KLF2的表达发挥干扰作用。有研究表明,KLF2蛋白主要通过抑制PI3K/AKT信号通路的转导,抑制肿瘤细胞的增殖和转移[18]。A498细胞中KLF2蛋白表达升高后,PI3K/AKT信号通路蛋白如p-AKT、p-mTOR表达显著降低,提示PI3K/AKT信号通路被阻滞。本研究进一步通过CCK-8法和Transwell实验检测表明,XLOC-013014表达增加后,A498细胞的增殖能力和迁移能力显著降低,表明XLOC-013014可抑制A498细胞的体外增殖能力和迁移能力。

综上所述,XLOC-013014在肾癌组织和细胞中呈低表达,XLOC-013014可通过“海绵样”方式结合并抑制miR-342-3p的表达,从而间接促进KLF2基因的表达,阻滞PI3K/AKT信号通路的转导,抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力。XLOC-013014可能在肾癌发生、发展中发挥重要作用,具有成为肾癌潜在的新的分子靶标的价值。