基于叶片显微结构综合评价马铃薯不同品种的抗旱性

马 胜，齐恩芳，文国宏，李 掌，曲亚英，郑永伟，白永杰，贾小霞*

（1.甘肃省农业科学院马铃薯研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室，甘肃 兰州 730070；3.国家种质资源渭源观测实验站，甘肃 渭源 748201）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）用途广泛，不仅关系到粮食安全，而且是解决贫困的支柱产业。近年来，随着国家马铃薯“主粮化”战略的推进，其在中国农业经济中的地位更加突出。西北半干旱区是中国马铃薯的主产区和优势产区，但干旱往往导致产量低而不稳。因此，研究马铃薯的抗旱性并进行科学评价具有重要的科学和实践意义。植物在生长过程中，由于受光照、气温、水分等自然环境因子的影响，根、茎、叶、花、果、实等形成了一套独特的外部形态特征[1]。作为与环境直接接触的主要器官，叶片是光合作用和呼吸作用的主要场所，其结构特征最易受到环境条件的影响，在不同的选择压力下形成了适应各种逆境的差异类型，其形态与解剖结构特征也充分显示了对不同生长环境的适应性[2]。目前，有关叶片形态特征与抗旱性的关系已受到很多学者关注[3,4]，研究表明，叶片厚度、中脉厚度、栅栏组织厚度、气孔密度[5,6]、叶片上下表皮厚度、海绵组织厚度、栅海比、栅栏组织结构紧密度、海绵组织结构疏松度[7,8]等叶片解剖结构特征参数可作为植物抗旱性评价的重要指标。目前对于马铃薯抗旱性的比较多集中在水分生理指标、渗透调节指标、光合作用指标、活性氧清除系统及膜脂过氧化指标、内源激素指标、产量指标[9,10]等方面。秦天元等[11]和卢福顺[12]分别研究了干旱胁迫对马铃薯根尖和叶片超微结构的影响，但基于叶片解剖结构对马铃薯不同品种进行抗旱性分析的研究还未见相关文献报道。因此，本研究选取甘肃省主栽的4个马铃薯品种，对其叶片解剖结构进行观测分析，并通过隶属函数法综合评价其抗旱性，旨在提供一些关于马铃薯抗旱栽培和抗旱育种方面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为马铃薯栽培种‘陇薯6 号’‘陇薯10号’‘陇薯14 号’和‘庄薯3号’原种（甘肃省农业科学院马铃薯研究所早熟育种研究室提供），试验在甘肃省农业科学院马铃薯研究所榆中试验站抗旱棚中开展，抗旱棚土壤为黄棉土，土壤肥力中上等，播前施羊粪40 m3/hm2、硫酸钾（K2O 50%）280 kg/hm2、磷酸二铵（P2O546%；N 18%）200 kg/hm2、尿素（N 46%）160 kg/hm2作基肥，浇透水后，于2020 年4月25 日土壤湿度适宜播种时露地平播，每品种3次重复，每重复2行，每行10株，行距60 cm，株距33 cm，播后不再浇水，直至盛花期采集叶片。榆中试验站位于N 35.85°，E 104.12°，海拔1 960 m，年均气温6.7℃，年均降水量350 mm，无霜期120 d左右，属温带半干旱区。

1.2 叶片组织结构观察

叶片组织结构采用石蜡切片法进行观察[13]。于2020年7月18日（盛花期）采集叶片，分别选取4个品种倒数第四个完全展开叶片，每个样品3 次重复，自来水冲洗干净后，横切叶片中部约2 cm×2 cm组织，先用FAA固定液固定，再用二甲苯和无水乙醇进行处理后，制作石蜡切片，番红固绿双重对染后进行封胶。使用PANNORAMIC 全景切片扫描仪将组织切片上所有的组织信息都扫描成像形成一个文件夹，使用CaseViewer2.2扫描浏览软件选取组织的目的区域进行200倍成像，成像完成后，叶片、上下表皮、叶片中脉、角质层、栅栏组织和海绵组织等各指标的厚度通过Image-Pro Plus 6.0软件进行测量分析，各指标均为10次测量值的平均值，然后求出栅海比、栅栏组织结构紧密度（RT）和海绵组织结构疏松度（RL）。

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度

RT（%）=栅栏组织厚度/叶片厚度×100

RL（%）=海绵组织厚度/叶片厚度×100

用Image-Pro Plus 6.0软件分别测量每张切片中6个气孔的宽度，并测量对应的12个保卫细胞的纵轴长与横轴长、整个组织的长度；分别计数组织上气孔数量与叶脉数量，计算出单位长度上气孔密度（n/mm）、单位长度上叶脉数量。

气孔密度（n/mm）=气孔数量/整个组织的长度

叶脉密度（n/mm）=叶脉数量/整个组织的长度

1.3 数据处理及分析

用Microsoft Office Excel 2010进行数据的初步处理，DPS V 3.01 统计分析软件进行单因素方差分析；试验结果的差异显著性用Duncan's分析，所有数据均为平均值±标准差。用模糊数学隶属函数法对不同品种进行抗旱性评价[14]，先求每个品种所有单一指标的隶属函数值，再计算不同品种所有指标的平均隶属函数值，平均隶属函数值的大小，分别代表抗旱性的强弱。与抗旱性呈正相关指标的隶属函数值用公式X（μ1）=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）计算，与抗旱性呈负相关指标的隶属函数值用公式X（μ2）=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）计算，式中X表示某一品种某一指标的测定值，Xmin表示4个品种中某一指标的最小值，Xmax表示4个品种中某一指标的最大值。

2 结果与分析

2.1 不同马铃薯品种叶片解剖结构共同特征

马铃薯叶片横切面解剖结构的基本组成相同（图1），即叶片为异面叶，由上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮组成，上表皮厚度和上表皮细胞都较大，下表皮厚度和下表皮细胞均较小且不规则。栅栏组织在上表皮下面，均由1层排列较紧密的长柱型细胞构成；在栅栏组织与下表皮之间的海绵组织，由排列疏松且形状不规则的细胞组成。

图1 不同马铃薯品种叶片横切面Figure 1 Cross-sections of different potato variety leaves

2.2 不同马铃薯品种叶片显微结构对比

不同品种马铃薯叶片的解剖特征参数量化上存在一定的差别（表1）。‘庄薯3 号’叶片厚度最大（178.32 μm），显著高于其他3个品种；‘陇薯10号’叶片厚度（170.62 μm）位居第二，显著高于‘陇薯6号’和‘陇薯14号’；‘陇薯14号’和‘陇薯6号’的叶片厚度较小，分别为157.64 和153.62 μm，二者有差异，但未达到显著水平。‘庄薯3号’的上表皮厚度最大（24.28 μm），显著高于其他3个品种；其余3个品种的上表皮厚度依次为‘陇薯6 号’（21.86 μm）、‘陇薯10号’（20.97 μm）和‘陇薯14号’（20.85 μm），他们之间互相都未达到显著水平。‘庄薯3号’的下表皮厚度最大（15.24 μm），显著高于其他3 个品种；其余3个品种的下表皮厚度依次为‘陇薯14号’（14.90 μm）、‘陇薯6号’（14.53 μm）和‘陇薯10号’（12.58 μm），‘陇薯14号’和‘陇薯6号’有差异，但差异不显著，但都显著高于‘陇薯10 号’。角质层厚度依次为‘陇薯 6 号’（5.69 μm）、‘陇薯 10 号’（5.14 μm）、‘庄薯3 号’（5.09 μm）和‘陇薯14 号’（4.62 μm），其中‘陇薯14 号’显著低于其他3 个品种。中脉厚度依次为‘陇薯14号’（1.21 mm）、‘陇薯6号’（1. 11 mm）、‘陇薯10号’（1.05 mm）和‘庄薯3号’（0.98 mm），其中‘庄薯3号’显著低于其他2个品种。‘庄薯3号’的栅栏组织厚度（63.88 μm）和海绵组织厚度（74.55 μm）都最大，显著厚于其他3个品种（‘陇薯10号’海绵组织厚度除外）；栅栏组织厚度和海绵组织厚度最小的品种分别为‘陇薯14 号’（55.06 μm）和‘陇薯6号’（67.77 μm），小于其他3个品种。各品种的栅海比、叶片RT和叶片RL虽然存在差异，但均未达到显著水平。

表1 不同马铃薯品种叶片解剖结构比较Table 1 Comparisons of anatomical structures of different potato variety leaves

2.3 不同马铃薯品种叶脉气孔特征对比

4个马铃薯品种的叶脉气孔特征见表2。保卫细胞纵轴长依次为‘庄薯3号’（11.66 μm）＞‘陇薯6号’（11.16 μm）＞‘陇薯14号’（10.83 μm）＞‘陇薯10号’（10.47 μm），其中‘庄薯3 号’显著高于‘陇薯10号’，与其他品种差异不显著。保卫细胞横轴长依次为‘庄薯3号’（8.47 μm）＞‘陇薯6号’（8.25 μm）=‘陇薯10号’（8.25 μm）＞‘陇薯14号’（8.19 μm），各品种间有差异，但差异不显著。气孔宽度值最大的是‘陇薯 14 号’（2.02 μm），显著高于其他 3 个品种，其余3 个品种的气孔宽度依次为‘陇薯6 号’（1.98 μm）、‘庄薯3 号’（1.77 μm）和‘陇薯10 号’（1.59 μm），他们之间有差异，但互相都未达到显著水平。‘庄薯3 号’气孔密度值最大（3.49 n/mm），显著高于其他品种，‘陇薯6 号’气孔密度值最小（1.73 n/mm），显著低于其他品种（‘陇薯14 号’除外）。叶脉密度依次为‘庄薯3号’（4.84 n/m）＞‘陇薯6号’（4.01 n/mm）＞‘陇薯10号’（3.75 n/mm）＞‘陇薯14号’（3.70 n/mm），其中‘陇薯10号’和‘陇薯14号’之间无显著差异，其余品种间差异显著。

表2 不同马铃薯品种叶片气孔结构的比较Table 2 Comparisons of stomatal structures of different potato variety leaves

2.4 抗旱性比较

由不同马铃薯品种叶片特征参数可以看出，单一指标并不能准确反映不同品种抗旱性的强弱，运用隶属函数法对叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅海比、栅栏组织结构紧密度、海绵组织结构疏松度、中脉厚度、气孔宽度和气孔密度等抗旱相关的叶片解剖结构特征参数的隶属函数值进行累加求平均值，综合评价参试品种的抗旱能力（表3），均值越大抗旱性越强，4个参试品种的抗旱性强弱依次为‘庄薯3号’＞‘陇薯10号’＞‘陇薯6号’＞‘陇薯14号’。

表3 马铃薯叶片9个指标隶属函数值及抗旱性综合评价Table 3 Membership function values of nine indexes of potato leaves and comprehensive evaluation of drought resistance

3 讨 论

作为与环境直接接触的植物器官，叶片是植物对环境变化最敏感的器官之一，其形态特征能够反映植物对干旱环境的适应能力，因此众多研究以叶片解剖结构作为评价植物抗旱性的重要指标[5-9]。研究表明，不同种类植物的叶片结构具有明显的差异[15]，同种植物叶片的解剖结构也表现出明显的差异[16,17]。在本研究中，4个马铃薯品种叶片均由角质层、上表皮、栅栏组织、海绵组织、下表皮和气孔构成。在叶片显微结构上均具有不同程度的防止水分散失的形态解剖特征，如上表皮细胞外附着有不透水的角质层，不但可以降低马铃薯的过度蒸腾作用以保持水分，而且通过其较强的折光性避免过强日照引起的损伤[18,19]；上下表皮气孔的均匀分布可以很好地散热，从而避免因热害而使原生质及叶绿体变性[20,21]。

参试马铃薯叶片虽然具有以上共同特征，但不同品种叶片的解剖结构特征参数值之间均显示出不同程度的差异，表现出各品种在生长过程中对环境适应的结果。关于叶片解剖结构特征与抗旱性关系的研究结果表明，叶片越厚、栅栏组织厚度越大、栅栏组织结构紧实度越大、栅海比值越高，植物的抗旱性越强，反之则抗旱性越差[3,4,22]。本研究中，不同品种叶片厚度在153.62～178.32 μm，其中‘庄薯3号’最大，‘陇薯6号’最小，表明从叶片厚度来看，‘庄薯3号’的抗旱性最强，‘陇薯6号’抗旱性最差。‘庄薯3 号’的栅栏组织厚度和栅海比都最大，‘陇薯14号’最小，表明从栅栏组织厚度和栅海比来看，‘庄薯3号’的抗旱性最强，‘陇薯14号’最差。海绵组织厚度越大，海绵组织疏松度越大，叶片抗旱性越差[22,23]。不同品种马铃薯叶片的海绵组织厚度和海绵组织疏松度分别为67.77～74.55 μm和41.79%～44.35%，海绵组织最厚的是‘庄薯3 号’，最薄的是‘陇薯6号’，而海绵组织疏松度最大的是‘陇薯6号’，最小的是‘庄薯3号’，如果从海绵组织厚度和海绵组织疏松度分别评价，二者体现的抗旱性强弱刚好相反。叶片中脉不仅起支持作用，还主要负责水分和养分的输送与贮存，中脉厚度越大，抵御干旱的能力越强[24]。不同品种的平均中脉厚度为1 084.67 μm，最厚为‘陇薯14号’，最薄为‘庄薯3号’，说明‘陇薯14号’抗旱性最强，‘庄薯3号’抗旱性最差；气孔作为植物与外界进行气体和水分交换的主要通道，是影响植物光合和蒸腾作用的重要因素，气孔越密越有利于植物进行光合作用；叶脉密度是影响水分运输的重要因素，叶脉越发达，叶片运输水分的能力越强，抗旱性强的品种都具有叶脉密度和气孔密度高的特征[25,26]。通过对4个品种叶片的气孔和叶脉进行观测，发现气孔密度最大为‘庄薯3号’，最小为‘陇薯6号’，分别显著高于和低于其他品种；叶脉密度最大为‘庄薯3号’，最小为‘陇薯14号’，分别显著高于和低于其他品种；如果从气孔密度和叶脉密度分别评价，二者体现的抗旱性最强的品种一致，均为‘庄薯3号’，但抗旱性最弱的品种并不一致。

以上分析表明，马铃薯叶片各解剖结构参数与抗旱性之间并无绝对的相关性，抗旱性的强弱不能完全由单一指标体现。隶属函数分析方法提供了一种在多指标测定基础上对某种特性综合评价的途径[27]，马铃薯叶片解剖结构参数蕴含众多的内容，为了防止单一指标的局限性，利用隶属函数分析方法进行综合评价。因此，本研究采用隶属函数法对参试品种的抗旱性进行评价，其中叶片厚度、栅栏组织厚度、栅栏组织结构紧实度、栅海比和气孔密度与抗旱性呈正相关，用公式X（μ1）=（X-Xmin）（/Xmax-Xmin）计算；海绵组织厚度和海绵组织疏松度与抗旱性呈负相关，用公式X（μ2）= 1-（X-Xmin）（/Xmax-Xmin）计算。综合评价结果显示，参试品种的抗旱性强弱依次为‘庄薯3 号’＞‘陇薯10 号’＞‘陇薯6号’＞‘陇薯14号’，其中‘陇薯10号‘’陇薯6号’和‘陇薯14号’的抗旱性强弱顺序与贾小霞等[28]以PEG胁迫下马铃薯幼苗抗逆生理指标为评价依据的研究结果一致。