亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与先天性心脏病的关联性研究

李倩 王华 张海燕 朱文英

【摘 要】目的：分析先天性心脏病（CHD）与亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因的两个多态位点C677T/rs1801133、A1298C/ rs1801131的相关风险。方法：应用病例-对照研究方法，选择2016年1月至2019年12月在昆山市第一人民医院就诊的129例先心病患儿为病例组，同期的112名无先心病的新生儿为对照组。基因分型采用Taqman探针法，血浆MTHFR水平的检测用间接酶联免疫吸附法。结果：两个位点C677T与A1298C的基因型分布差异在病例组与对照组中无统计学意义（rs1801131 P=0.276；rs1801133 P=0.365），血浆MTHFR水平在病例组与对照组中无统计学差异（P= 0.079）。结论：MTHFR基因遗传变异与先心病的易感性无明显关联，此研究结果尚需大样本研究和后续功能学的进一步验证。

【关键词】先天性心脏病；MTHFR基因；遗传变异

The association study between MTHFR polymorphisms and congenital heart disease

Li Qian， Wang Hua， Zhang Haiyan， Zhu Wenying （corresponding author）

Department of Pediatrics， The First People’s Hospital of Kunshan，Jiangsu， Jiangsu Kunshan 215300， China

【Abstract】Objective： To analyze the risk of congenital heart disease （CHD） and two polymorphic loci C677T / rs1801133 and A1298C / rs1801131 of methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR） gene.Methods： Using the case-control study method， 129 children with congenital heart disease treated in the first people，s hospital of Kunshan from January 2016 to December 2019 were selected as the case group ， and 112 newborns without congenital heart disease in the same period were selected as the control group. Taqman probe method was used for Genotyping，ELISA was used to detected the serum MTHFR level.Results： There was no significant difference in genotype distribution of C677T and A1298C between the case group and the control group （rs1801131 P= 0.276； rs1801133 P= 0.365）， and there was no significant difference in plasma MTHFR level between the case group and the control group （P= 0.079）. Conclusion： There is no significant association between genetic variation of MTHFR gene and susceptibility to CHD. The results of this study need to be further validated by large sample studies and subsequent functional studies.

【Key？Words】Congenital heart disease； MTHFR gene； Genetic variation

先天性心臟病（congenital heart disease， CHD）是胎儿时期心血管异常发育导致的一组畸形的总称，它是在怀孕期间前6周心脏未完全发育，表现为心脏及大血管形成障碍而引起局部解剖结构异常。研究表明，大多数先心病是由遗传和环境因素共同引起，其中同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）的代谢异常在先心病的发病机制中有重要作用[1-2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢中的一种关键酶，其作为甲基的间接供体参与核苷酸的重新合成，维持体内正常的HCY水平。MTHFR基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms， SNP）可以影响基因的功能从而影响酶的活性，进而影响HCY的代谢水平[3]。本研究对MTHFR基因C677T/ rs1801133和A1298C/rs1801131两多态位点及血浆MTHFR水平与新生儿先心病发生的相关性进行探讨。

1.1 研究对象

病例为2016年1月至2019年12月在江苏省昆山市第一人民医院新生儿科就诊的有明确诊断的先心病新生儿患者，共收集129例。对照为同时期出生的健康的新生儿，与病例组性别匹配，共112例。研究对象监护人均签署知情同意书。对所有参与流行病学调查和样本收集人员进行培训。由管床医生填写调查表，包括一般情况、生活史和家族史等可导致患先心病的因素。EDTA抗凝管采集静脉血2ml，分离血浆，提取DNA，于-80°C冰箱中储存。

1.2 MTHFR基因型分析

1.2.1 选择SNPs位点 用NCBI数据库筛选出具有潜在功能学效应的SNP位点并参考HapMap数据库，选出中国汉族人群中最小等位基因频率大于5%的SNPs。

1.2.2 DNA提取与Taqman探针 采用TIANGEN试剂盒提取DNA，Taqman探针法进行基因分型，仪器为罗氏LC96，扩增引物序列见表1。

1.3 血浆MTHFR水平检测

采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中MTHFR水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（χ±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 流行病学

病例组129例，男性68例，女性61例，均为新生儿，包括：动脉导管未闭76例，房缺20例，室缺7例，动脉导管未闭合并房缺18例，动脉导管未闭合并室缺3例，房缺合并室缺3例，动脉导管未闭合并房室缺2例。对照组112例，男性66例，女性46例，为同期出生的新生儿，经心超检查未见异常，且无重大疾病，年龄性别与病例组无统计学差异。

2.2 位点多态性与先天性心脏病风险的关系

对两个SNP位点与先心病易感的关联性进行分析，两位点的差异在病例组与对照组中无统计学意义（P值分别为0.276，0.365），见表2。

2.3 血浆MTHFR水平与基因型的关系

质量合格的血浆样本共74例，病例组24例，MTHFR水平为1051.70±688.28ng/L；对照组50例，MTHFR水平为786.67±552.76ng/L。两者无统计学差异（P=0.079），见图1。

研究表明妊娠早期补充叶酸和维生素B12的女性，婴儿发生先心病风险会降低[4-5]。MTHFR基因多态性研究最多的C677T位点的遗传变异使氨基酸编码序列改变，导致MTHFR酶的活性下降。有研究发现携带突变的T等位基因会增加房缺和动脉导管未闭的发生风险，提示C677T位点突变可能与先心病有关[6]。有学者发现在肺动脉瓣狭窄及肺动脉闭锁的患者中携带C677T明显高于对照组，提示该突变可能是先心病发生的危险因素[7]。然而，对美国加利福尼亚州1987年和1988年出生的人进行回顾性研究，发现携带MTHFR C677T并不会增加先心病的发生[8]。Fernbach等也未发现该位点与先心病之间存在关联[9]。

有研究报道MTHFR A1298C突变纯合子CC编码的酶活性比野生型纯合子AA编码的酶活性低40%[10]。但有动物实验表明，MTHFR基因A1298C位点突变是子代发生先心病的保护因素[11]。得出上述不同结论的可能原因如下：A1298C和C677T可发生连锁不平衡，将其作用混淆；MTHFR基因的A1298C变异使胎儿MTHFR酶的活性降低，嘧啶和嘌呤的合成被抑制，错误碱基的合成下降，以此保护心脏正常发育[11]。

本研究采用病例-對照研究方法，探讨MTHFR C677T和A1298C及血浆中MTHFR水平与先心病发生的关联。结果发现两SNP位点突变与先心病发生无关联，两组血浆中MTHFR水平也无统计学差异。此结果可能与种族及样本量偏少有关，因而需大样本研究和后续功能学的进一步验证。同时，先心病为多基因致病，因而后期可进一步用高通量及高效率技术检测基因多位点的突变。

参考文献

[1] LANGE L A，CROTEAU-CHONKA D C，MARVELLE A F，et al.Genome-wide association study of homocysteine levels in Filipinos provides evidence for CPS1 in women and a stronger MTHFR effect in young adults[J].Human Molecular Genetics，2010，19（10）：2050-2058.

[2] VERKLEIG-HAGOORT A C，VERLINDE M，URSEM N，et al.Maternal hyperhomocysteinaemia is a risk factor for congenital heart disease[J].An International Journal of Obstetrics and Gynaecology，2006，113，（12）：1412-1418.

[3] 王淑媛，等.MTHFR、MTRR基因多态性及Hcy水平与胎儿先天性心脏病的相关性[J].中国妇幼保健，2018，33（6）：2521-2524.

[4] IONESCU-ITTU R，MARELLI A J，MACKIE A S，et al.Prevalence of severe congenital heart disease after folic acid fortification of grain products： time trend analysis in Quebec. Canada[J]. BMJ，2009（338）：673.

[5] A VERKLEIJ-AGOORT，Bliek J，F Sayed㏕Abatabaei，et al.Hyperhomocysteinemia and MTHFR polymorphisms in association with orofacial clefts and congenital heart defects： ameta-analysis. American Journal of Medical Genetics[J].Part A，2007，143（9）：952-960.

[6] WENLI，L，ZHU，et al.Maternal and offspring MTHFR gene C677T polymorphism as predictors of congenital atrial septal defect and patent ductus arteriosus[J].Mol Human Reprod，2006，12（1）：51-54.

[7] LEE C N，SU Y N，CHENG W F，et al.Association of the C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation with congenital heart diseases[J].Acta Obstet Gynecol Scand，2005，84（12）：1134-1140.

[8] GIUSTI B.Phenotypic variability of cardiovascular manifestations in Marfan syndrome. Possible role of hyperhomocysteinemia and C677T MTHFR gene polymorphism[J].Eur Heart J，2003，24（22）：2038-2045.

[9] MCBRIDE K L，FERNBACH S，MENESSES A，et al.A family-based association study of congenital left-sided heart malformations and 5，10 methylenetetrahydrofolate reductase[J].Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2004，70（10）：825-830.

[10] Rudd M F，SELLICK G S，ALLINSON R，et al.MTHFR polymorphisms and risk of chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（12）：2268-2270.

[11] ZETTERBERG H，REGLAND B，M PALMER，et al.Increased frequency of combined methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C mutated alleles in spontaneously aborted embryos[J].Eur JHum Genet，2002，10（2）：113-118.

基金項目：苏州市市“科教兴卫”青年科技項目《LncRNA MALATl在评估紫绀型先天性心脏病患者心肌慢性缺氧适应中的临床价值研究》（KJXW2018069）。