Fe3+抑制醋酸棉酚对脑胶质瘤细胞的杀伤作用

黄雪阳，杨梦婷，房文静，龚爱华

(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

脑胶质瘤呈浸润性生长，侵袭性强，极易复发，预后差，严重影响患者生存期及生存质量[1]。当前对于脑胶质瘤的治疗手段以手术结合术后放疗和化疗为主，但效果有限[2]。前期研究表明，醋酸棉酚(gossypol, GAA)能诱导细胞自噬性死亡及促进肿瘤细胞凋亡[3]。然而临床研究表明，GAA在复发性胶质瘤患者中显示出低但可测量的缓解率[4]，疗效不及预期，其具体原因尚未阐明。

低氧、高渗是肿瘤微环境的重要特征，其中Fe3+在脑胶质瘤微环境中处于较高水平。相较于正常细胞，癌细胞对Fe3+需求量更高[5-6]。有报道称GAA具有较好的螯合Fe3+的能力[7]，由此推测肿瘤微环境中的Fe3+可能通过与GAA结合发挥作用，但Fe3+是否能够抑制GAA对脑胶质瘤的杀伤作用尚不清楚。因此，本研究拟探讨Fe3+对GAA杀伤人脑胶质瘤细胞作用的影响。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

通过Cancer Brower下载TCGA数据库中胶质瘤患者mRNA表达及临床相关数据，分析转铁蛋白受体c(transferrin receptor c, TFRC) mRNA在健康者与脑胶质瘤患者中的表达水平。以平均值为界，将高于和低于平均值分别定义为高表达组和低表达组。

利用基因表达谱在线分析平台GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TFRC与脑胶质瘤患者生存的相关性。数据筛选条件：“Gene：TFRC”；“Analysis Type：Survival”；“Datesets Selection：GBM and LGG”。

1.2 细胞及试剂

人脑胶质瘤LN229、SW1783、U87MG、U251MG细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院；GAA(上海生工生物公司)；FeCl3·6H2O(上海Aladdin公司)；高糖DMEM(美国Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美国Gibco公司)；Transwell小室(美国Coming Incorporated公司)；CCK-8试剂盒(南京诺唯赞公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)。

1.3 细胞培养

配制含有10%胎牛血清的高糖DMEM；各胶质瘤细胞株均使用上述培养基且放置于37 ℃，5% CO2及饱和湿度的恒温细胞培养箱中常规培养；生长密度达70%～90%时，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶进行消化处理。

1.4 计算GAA在不同人脑胶质瘤细胞中的半数作用浓度(IC50)

将人脑胶质瘤LN229、SW1783、U87MG、U251MG细胞按每孔2×103个细胞接种于96孔板，将高浓度GAA储存液用高糖DMEM逐步稀释为0、5、10、15、20、25 μmol/L，每孔分别加入100 μL GAA，于培养箱中孵育72 h；弃上清液，加入CCK-8工作液检测各孔450 nm波长处光密度(D)值，计算细胞活性。重复实验3次。利用GraphPad 6.0软件计算在不同脑胶质瘤细胞中GAA的IC50作为后续实验浓度。

1.5 细胞实验及相关指标检测

1.5.1 细胞分组及处理 将4种人脑胶质瘤细胞各分为对照组，Fe3+组，GAA组，Fe3++GAA组，分别予以培养基，FeCl3·6H2O，GAA，FeCl3·6H2O+ GAA处理。GAA浓度以各胶质瘤细胞IC50为准，FeCl3·6H2O浓度与GAA浓度相同。

1.5.2 CCK-8法检测细胞增殖率 取2×103个人脑胶质瘤细胞接种于96孔板，每组设立3个复孔，每孔中加入100 μL培养基，于细胞培养箱中培养过夜。次日细胞贴壁，按上述分组处理细胞，于培养箱孵育72 h，避光条件下按照无血清DMEM ∶CCK-8试剂为9 ∶1的比例配制CCK-8工作溶液，每孔加入100 μL工作溶液，并设立 3个空白复孔(无细胞)加入配置好的CCK-8工作液行D值校正；继续孵育1～2 h，用酶标仪检测450 nm波长处各孔D值。检测细胞每日增殖情况，连续6 d在同一时间点检测。细胞活性(%)=(D实验组-D空白组)/(D对照组-D空白组)×100%。

1.5.3 Transwell实验检测细胞迁移能力 取对数生长期胶质瘤细胞均匀接种于6孔板，次日细胞贴壁按上述分组处理细胞48 h。取24孔板，将Transwell小室放置于24孔板中，小室底部24孔板内加入500 μL含10%胎牛血清的高糖培养基，用无血清DMEM将6×104个细胞重悬稀释至200 μL加入小室上层。培养箱中培养14～16 h；弃培养基，PBS清洗1次，加入4%多聚甲醛，室温固定30 min；PBS洗涤，加入0.1%结晶紫染色30 min；PBS洗涤2～3次，将剩余染液甩干，用棉签轻轻抹去小室内侧未穿透的细胞及多余液体；于显微镜10倍镜下拍照，运用Image J软件进行细胞计数。实验重复3次。

1.5.4 流式细胞术分析细胞凋亡水平 选取LN229、U251MG细胞，按上述分组处理细胞48 h，收集各组细胞上清液，PBS洗涤剩余贴壁细胞，用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，于培养箱中温育1～2 min；加入已收集的细胞上清液终止消化，收集细胞，1 000×g，离心5 min；弃上清液，PBS重悬计数1×105胶质瘤细胞，重复上述离心，弃上清液，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，吹散细胞团块，再加入5 μL Annexin V-FITC，吹打混匀；加入10 μL碘化丙啶染色液，吹打混匀；避光室温孵育10～20 min；流式细胞仪检测各组细胞凋亡水平，用FlowJo V10软件对流式数据进行分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 TFRC在胶质瘤中的表达与生存分析

在TCGA脑胶质瘤数据库中记录有脑组织样本370例，其中脑胶质瘤患者163例，健康对照者207例。与健康对照者相比，脑胶质瘤患者组织中TFRCmRNA表达水平显著增高(P<0.05)，提示脑胶质瘤中Fe3+富集。另通过GEPIA数据库分析可知，TFRC高表达组胶质瘤患者总体生存率明显低于低表达组(P<0.05)。见图1。

图1 TFRC在脑胶质瘤中表达情况与患者生存分析

2.2 GAA抑制脑胶质瘤细胞增殖

CCK-8结果显示，与0 μmol/L相比，10、15、20、25 μmol/L GAA组LN229、SW1783、U251MG细胞存活率明显降低(P均<0.05)；15、20、25 μmol/L GAA组U87MG细胞存活率明显降低(P均<0.05)。通过GraphPad Prism计算得出LN229、SW1783、U87MG、U251MG细胞的IC50分别为9.38 μmol/L、9.56 μmol/L、14.53 μmol/L和10.39 μmol/L。见图2。

*：P<0.05，与0 μmol/L GAA组相比

2.3 Fe3+促进GAA处理条件下胶质瘤细胞增殖

结果显示，在LN229、SW1783、U87MG、U251MG 4种脑胶质瘤细胞中，与对照组相比，GAA组细胞相对增殖率均显著降低(t分别为72.28、193.03、114.35、290.04，P均<0.05)；而与GAA组相比，Fe3++GAA组脑胶质瘤细胞增殖率明显升高(t分别为51.57、46.17、40.60、9.14，P均<0.05)。见图3。由此表明，Fe3+可逆转GAA引起的脑胶质瘤细胞死亡。

CCK-8结果表明，与对照组相比，GAA组SW1783和U87MG胶质瘤细胞在3～6 d时，另外两种细胞在4～6 d时细胞相对增殖率显著降低(P均<0.05)；而与GAA组相比，Fe3++GAA组细胞相对增殖率显著升高(P<0.05)，Fe3+对于GAA杀伤胶质瘤细胞的逆转效果并未随着时间的延长而有所降低(P均<0.05)。由此可见，Fe3+可使脑胶质瘤细胞持续抵抗GAA的杀伤。见图4。

*：P<0.05，与对照组相比；#：P<0.05，与GAA组相比

*：P<0.05，与对照组相比；#：P<0.05，与GAA组相比

2.4 Fe3+促进GAA处理条件下胶质瘤细胞迁移

Transwell结果显示，在LN229、SW1783、U87MG、U251MG 4种脑胶质瘤细胞中，与对照组相比，GAA组细胞迁移数量显著降低(P均<0.05)；但与GAA组相比，Fe3++GAA组的脑胶质瘤细胞迁移数量则显著增多(P均<0.05)。见图5。

*：P<0.05，与对照组相比；#：P<0.05，与GAA组相比

2.5 Fe3+抑制GAA引起的胶质瘤细胞凋亡

流式细胞术结果显示，与对照组相比，GAA组脑胶质瘤细胞凋亡率明显增加(LN229：t=15.73，U251MG：t=42.69；P均<0.05)；与GAA组相比，Fe3++GAA组脑胶质瘤细胞凋亡率明显降低(LN229：t=13.29，U251MG：t=45.16；P均<0.05)。见图6。

*：P<0.05，与对照组相比；#：P<0.05，与GAA组相比

3 讨论

研究揭示，68Ga-citrate(一种Fe3+仿生药)可以以远高于正常组织的倍数在U87MG皮下瘤中蓄积[8]。在高级别脑胶质瘤中，更易因为病理血管的小出血导致肿瘤内或肿瘤周围的Fe3+水平升高[9]。本研究生物信息学研究结果与其相一致，脑胶质瘤组织中TFRCmRNA表达水平显著高于正常脑组织，且TFRC高表达组胶质瘤患者总体生存率明显低于低表达组。Fe3+在血清中与转铁蛋白结合，经细胞膜TFRC识别。在核内体的酸性环境条件下，Fe3+经前列腺六次跨膜蛋白(STEAP)还原酶还原成 Fe2+，通过二价金属转运体1从核内体转出，释放至不稳定铁池中[10]。TFRC作为Fe3+转运过程中所必需的受体蛋白，其高表达提示脑胶质瘤微环境中Fe3+的高含量，由此表明Fe3+过载可能与脑胶质瘤的不良预后相关。

体外实验研究发现，GAA可以有效杀伤对于一线化疗药物替莫唑胺耐药的脑胶质瘤细胞[11]。本研究结果表明，GAA对于4种脑胶质瘤细胞均能发挥杀伤作用且呈浓度依赖性。然而GAA在二期临床试验中疗效却不如预期[4]，造成体内外结果差异的具体原因尚未得以阐释。本研究结果证实，在4种脑胶质瘤细胞中加入外源性Fe3+处理72 h明显促进GAA处理的细胞增殖、迁移能力。进一步将实验时间延长至6 d，Fe3+对脑胶质瘤细胞对于GAA耐药具有持续且显著的促进作用。这或许可以从一定程度上解释脑胶质瘤细胞对于GAA耐药的原因，但其具体机制还有待于进一步阐明。

早期研究证明，GAA作为BH3类似物能够与BCL2上的BH3结合域结合，降低BCL2的表达，诱导细胞凋亡[12-13]。本研究选用前神经型脑胶质瘤U251MG细胞及间质型脑胶质瘤LN229细胞验证了GAA可以通过诱导脑胶质瘤细胞凋亡来发挥其杀伤作用，GAA与Fe3+联用后细胞凋亡水平降低，因此初步推测Fe3+通过与GAA 结合，从而阻止GAA与 BCL2结合，保证BCL2抗凋亡功能，促进肿瘤细胞抗凋亡。

综上所述，脑胶质瘤微环境中的Fe3+可能通过结合GAA介导脑胶质瘤细胞的化疗耐药，但具体机制还需要进一步探究。本研究或许可以为脑胶质瘤的临床治疗提供潜在的治疗方案，如将GAA与铁离子螯合剂联用以消除Fe3+对于GAA药物敏感性的影响等。