乳粉中维生素K1含量不确定度评定分析

罗渺琴

（广东东泰乳业有限公司公司，广东揭阳 515500）

高效液相色谱法、气相色谱－质谱法、液相色谱－串联质谱法均属于乳粉中维生素K1含量测定的常用方法，在大批量检测方面，本文研究的高效液相色谱法表现突出，其他两种方法测定成本较高，不适合开展大批量检测。但如果乳粉的基质较为复杂，高效液相色谱法可能无法满足检测需求，为保证高效液相色谱法更好服务于相关检测，本文围绕乳粉中维生素K1含量不确定度评定开展具体研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钾、脂肪酶、氯化锌、冰乙酸、正己烷、碳酸钾、无水乙酸钠、甲醇、四氢呋喃、无水乙醇和维生素K1标准品，其中甲醇、四氢呋喃均为色谱纯，无水乙酸钠、磷酸二氢钾分别为优级纯、分析纯，维生素K1标准品拥有99%以上纯度[1]。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪、反相色谱柱，型号分别为U-3000、AQC18，反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

按照0.000 1 g精度称取乳粉样品2.0 g置入具塞三角瓶（150 mL），加入纯水7 mL，温度控制在50 ℃，摇匀使乳粉样品充分溶解，之后将磷酸盐缓冲液加入其中并混匀，加入量为5 mL。加入脂肪酶0.2 g，充分混合后在恒温水浴振荡器中进行2 h振荡处理，温度设置为（37±2）℃，确保充分酶解。

试样酶解好后分别加入碳酸钾1 g及无水乙醇10 mL，混合均匀后将水、正己烷各10 mL加入其中，振荡或涡旋提取10 min，离心5 min，速度设置为6 000 r/min，转移上清液至旋转蒸发瓶（100 mL）中，之后加入正己烷10 mL，重复操作，进一步向旋转蒸发瓶中转移上清液。旋蒸至近干，氮气吹干后加入甲醇5 mL并摇匀，通过0.22 μm滤膜进行过滤，滤液待进样

1.3.2 色谱条件

参考《食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》（GB 5009.158—2016）内容，设定流速为1 mL/min，激发波长、发射波长分别为243 nm、430 nm，进样量为10 μL。实验用数学模型为：

式中：V1-提取液总体积，mL；V3-定容液总体积，mL；V2-分取的提取液体积，mL；X-维生素K1含量，μg/100 g；ρ-试样溶液中维生素K1浓度，ng/mL；m-试样质量，g。

不确定度的来源可细分为6个方面，包括样品质量引入、标准品校正引入、样品体积引入、仪器引入、标准曲线引入、样品测量重复性引入的标准不确定度[2]。

2 维生素K1含量不确定度评定

2.1 样品质量引入

实验过程需要称取样品2.000 0 g，由于存在0.5 mg的扩展不确定度及具体值为2的包含因子，可确定其存在1.25×10-3相对标准不确定度，计算过程为：

2.2 标准品校正引入

2.2.1 标准工作液引入的合成相对不确定度

（1）不确定度会因标准溶液校正引入。容量瓶（100 mL）定容标准工作液存在±0.10的最大允许误差，属于三角分布，因此可确定容量瓶存在4.08×10-4的相对标准不确定度，计算过程为：

（2）移液管（1 mL分度）在配置标准工作液过程中应用，其存在0.008的最大允许误差，属于三角分布，因此可确定存在3.27×10-3相对标准不确定度，计算过程为：

对于20 ℃条件下校正的玻璃器具，结合（20±5） ℃的实验室温度，可通过估算体积膨胀系数和温度范围确定温度波动带来的不确定度，同时可忽略远小于液体膨胀系数的玻璃膨胀系数。

（3）通过甲醇稀释进行标准工作液配制，移取使用移液管（1 mL分度）并在容量瓶（100 mL）中定容，基于20 ℃条件下0.001 2（1/℃）的甲醇膨胀系数，标准不确定度计算需假设存在矩形分布的温度变化，因此可得到3.46×10-3标准不确定度，计算过程为：

基于标准工作液进行分析，用urel（Ca）、urel（Cb）、urel（Cc）分别代表容量瓶、移液管、甲醇引入的相对标准不确定度。最终可得到5.90×10-3的合成相对标准不确定度，计算过程为：

2.2.2 标准品校正时的标准不确定度

还需要围绕仪器在标准品校正时的标准不确定度进行分析，结合仪器存在的0.5%扩展不确定度及具体值为2的包含因子[3]，可确定相对标准不确定度为2.5×10-3，计算过程为：

因此存在6.41×10-3的标准品引入合成相对标准不确定度，用urel（C0）、urel（C1）分别代表标准工作液、分光光度计校正引入的合成相对标准不确定度。计算过程为：

2.3 样品体积引入

旋转蒸发仪蒸干的样品需要对剩余样品进行甲醇溶解处理，这一过程使用移液管（5 mL分度），其存在±0.025的最大允许误差，属于三角分布，可由此确定其存在2.04×10-3的相对标准不确定度，计算过程为：

采用相同方法，基于20 ℃条件下0.001 2（1/℃）的甲醇膨胀系数且假设存在矩形分布的温度变化，温度波动存在3.47×10-3相对标准不确定度。围绕样品体积进行分析可以确定，其存在4.03×10-3引入的合成相对标准不确定度[4]。

2.4 仪器引入

结合检定证书信息可以确定，实验使用的高效液相色谱仪仪器存在0.1%的相对扩展不确定度及具体值为2的包含因子，因此可确定存在5×10-4相对标准不确定度，计算过程为：

2.5 标准曲线引入

开展0.380 μg/mL、0.190 μg/mL、0.095 μg/mL、0.038 μg/mL、0.019 μg/mL和0.01 μg/mL质量浓度的维生素K1标准工作曲线配制，分别开展1次测量，标准溶液质量浓度－峰面积曲线通过最小二乘法拟合，标准曲线为[5]：

式中：a、b、c、分别为标准溶液的浓度（校准用）、斜率、截距、峰面积，ˆ与校准用标准溶液浓度对应。

结合计算获得的数据分析截距、斜率、相关系数关系可以发现，截距、斜率、相关系数的值分别为24.595 93、21 077.995 2、0.999 92，因此可得到校准曲线A，即：

开展奶粉试样平行测定2次，可确定样1、样2的峰面积分别为5 540.22、5 563.56，浓度分别为0.261 μg/mL、0.264 μg/mL，含量分别为65.413 88 μg/100 g、65.692 82 μg/100 g，结合平均试样浓度和平均峰面积，可确定2次重复测定能够带来0.663%的相对标准不确定度，计算过程为：

2.6 样品测量重复性引入

开展维生素K1平行测试，目标为同一批次乳粉试样，总的分析数据随机变化能够由此获取，如测定次数为1、3、7、10 时的测定结果分别为 65.4 μg/100 g、66 μg/100 g、63.6 μg/100 g、60.6 μg/100 g，10 次平均值为 64.2 μg/100 g。围绕重复测量样品开展评定，平均值标准偏差用于平均值的标准不确定度表征，可得到8.03×10-3的相对标准不确定度，计算过程需结合所测结果r的平均值标准偏差及标准不确定度，分别表示为可得到计算公式：

2.7 相对标准不确定度合成

结合测量样品质量、标准品校正、样品体积、仪器、标准曲线和样品测量重复性共6种来源的相对标准不确定度，可确定乳粉中K1测定过程中高效液相色谱法的不确定度，即0.977 25 μg/100 g，用urel（C）、urel（V）、urel（m）、urel（q）、urel（s）、urel（r）分别代表标准品、样品定容体积、样品质量、标准曲线、仪器、测量重复性的相对标准不确定度。计算过程为：

2.8 扩展不确定度

结合数值为2的包含因子及95%的置信水平，可通过计算得到扩展不确定度，具体数值为1.954 5 μg/100 g，计算过程为：

3 结论

通过对实验过程进行分析可以发现，乳粉维生素K1测定中，高效液相色谱法的实用性较高，能够确定样品质量、标准品校正、样品体积、仪器、标准曲线和样品测量重复性等方面引入的不确定度，高效液相色谱法应用中受到的最小二乘法拟合曲线影响最大，因此可以确定其涉及的浓度值属于不确定度测量的主要影响因素，在高效液相色谱法的应用中必须对其进行针对性控制，以此得到可靠性更高的检测结果，同时保证测量结果间存在更高的可比性，为测定乳粉维生素K1含量提供更好的支持。