Survivin、Ki67及HPV16-E6的联合检测在宫颈癌发生、发展中的作用机制

陈丽珍 沈菲 李菁

[摘要] 目的 探討存活素（Survivin）、Ki67及人乳头状瘤病毒（HPV）16-E6联合检测在宫颈癌发生、发展中的作用机制。 方法 选择2018年1月至2020年12月我院收治的130例女性患者，其中正常对照组32例，低级别CIN组36例，高级别CIN组34例，宫颈癌组28例。所有患者均行免疫组化及流式细胞学检查。分析各组免疫组化检测结果、各组流式细胞检测结果，另分析各蛋白在宫颈癌表达中的相关性。 结果 宫颈癌组Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白阳性率均高于高级别CIN组及低级别CIN组，差异有统计学意义（P<0.05）;低级别CIN组、高级别CIN组与宫颈癌组Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比较，差异有统计学意义（P<0.05）;Survivin、Ki67相关性检验显示，r=0.534，一致性检验Kappa=0.512，P=0.006;Ki67及HPV16-E6蛋白相关性检验显示，r=0.714，Kappa=0.708，P=0.000;Survivin及HPV16-E6蛋白相关性检验显示，r=0.523，Kappa=0.627，P=0.001。 结论 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白与宫颈癌发生及发展间存在密切联系，检测各指标进行宫颈癌早期筛查，利于尽早发现病变。

[关键词] 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;宫颈癌前病变;人乳头状瘤病毒;存活素;Ki67

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）36-0009-04

Mechanism of action of Survivin， Ki67 and HPV16-E6 combined detection in occurrence and development of cervical cancer

CHEN Lizhen   SHEN Fei   LI Jing

Department of Obstetrics and Gynecology， the First People's Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen   333000，China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of action of combined detection of Survivin， Ki67 and human papillomavirus（HPV） 16-E6 in the occurrence and development of cervical cancer. Methods A total of 130 female patients who were admitted to our hospital from January 2018 to December 2020 were selected， including 32 patients in the normal control group， 36 patients in the low grade CIN group， 34 patients in the high grade CIN group and 28 patients in the cervical cancer group. All patients were examined by the immunohistochemistry and flow cytometry. Immunohistochemical results and flow cytometry results of each group were analyzed， and the correlation of each protein in the cervical cancer expression was analyzed. Results  The positive rates of Survivin， Ki67 and HPV16-E6 protein in cervical cancer group were higher than those in the high grade CIN group and the low grade CIN group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Survivin， Ki67 and HPV16-E6 protein FI values of the low grade CIN group， the high grade CIN group and the cervical cancer group were significantly different （P<0.05）. The Survivin and Ki67 correlation test showed r=0.534， the consistency test Kappa=0.512， P=0.006. The Ki67 and HPV16-E6 protein correlation test showed r=0.714， Kappa=0.708， P=0.000. The Survivin and HPV16-E6 protein correlation test showed r=0.523， Kappa=0.627， P=0.001. Conclusion Survivin， Ki67 and HPV16-E6 proteins are closely related to the occurrence and development of cervical cancer， and detection of these indicators is conducive to early detection of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Cervical precancerous change; Human papillomavirus; Survivin; Ki67

宫颈癌属妇科恶性肿瘤，其中人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染是宫颈癌发生的主要危险因素[1]。宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasias，CIN）属于宫颈癌前病变，若可尽早发现CIN，对宫颈癌预防具有重要作用[2-3]。存活素（Survivin）参与了多种血管因子的相互作用，可有效抑制血管内皮细胞凋亡及毛细血管的退化，在宫颈癌发生及发展中意义重大[4-5];Ki67抗原为非组蛋白，水平越高，肿瘤恶性程度越高，预后较差，反之，预后越好[6-7];临床依据HPV病毒基因区可分为多个区，E6作为多功能蛋白还可通过激活端粒酶使得正常细胞永生化，与其他蛋白存在相互作用[8-9]。鉴于此，本研究采用Survivin、Ki67及HPV16-E6的联合检测，旨在探讨在宫颈癌中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月至2020年12月于我院就诊的女性患者130例，本研究获得医院医学伦理委员会批准。采集所有患者的宫颈组织，其中正常对照组32例，低级别CIN组36例，高级别CIN组34例，宫颈癌组28例。其中正常对照组年龄38～52岁，平均（45.57±3.61）岁;孕次1～4次，平均（2.05±0.63）次;产次1～3次，平均（1.84±0.43）次。低级别CIN组年龄37～52岁，平均（45.60±3.59）岁;孕次1～4次，平均（2.13±0.60）次;产次1～3次，平均（1.78±0.40）次。高级别CIN组年龄37～53岁，平均（45.81±3.71）岁;孕次1～5次，平均（2.20±0.59）次;产次1～4次，平均（1.80±0.42）次。宫颈癌组年龄36～53岁，平均（45.79±3.68）岁;孕次1～5次，平均（2.19±0.67）次;产次1～4次，平均（2.18±0.60）次。四组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①所有患者术前均未接受放、化疗治疗，且均经病理组织学明确诊断[10];②签署知情同意书。排除标准：①癌细胞已发生远端转移者;②其他重要脏器功能障碍者;③病历资料不全者;④精神疾病，无法配合完成本研究者。

1.3 方法

（1）免疫组化S-P法：①对石蜡标本行连续切片，大小为4 cm，将其平铺于APES的载玻片上，并置于恒温67℃烤箱中过夜。②过夜切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脱蜡10 min;③将标本置于100%酒精内5 min，再置于90%酒精内5 min，随后再置入70%酒精内5 min，最终使用自来水大量冲洗标本后用蒸馏水冲洗3 min。④将标本孵育20～25 min，并将其置入含有3%甲醇过氧化氢溶液中，随后用蒸馏水冲洗切片，每次3 min，冲洗3次，随后置于0.01 M PBS内5 min。⑤将Survivin及HPV16-E6置于PBS液压高压锅内喷气150 s，Ki67置于含有枸橼酸钠溶液高压锅内喷气4 min，随后将三种置于温室内冷却，随后2次放入PBS溶液内，5 min/次。⑥吸出多余液体，用血清封闭，置于湿盒中孵育45 min，保证湿盒温度为37℃;⑦倒去血清，滴加50 μL抗工作液，将其置于4℃湿盒内过夜，PBS冲洗3次，5 min/次。⑧将二抗工作液滴入标本中，置于湿盒内孵育30 min，PBS冲洗5 min，3次;⑨于样本中滴加链酶卵白素工作液，并在37℃环境中孵育30 min，PBS冲洗5 min，共冲洗3次。⑩DAB染色。使用中性树胶等物质封片，于显微镜下进行观察，将PBS代替一抗作为空白对照，另之前标本使用70%乙醇固定，用于流式细胞检测。（2）流式细胞检查方法：①将标本置于120目不锈钢网上，随后使用眼科常用的组织剪剪碎试验标本组织，使用眼科镊子进行揉搓块，在此过程中，大量冲洗标本，直至标本揉搓完毕，使用300目过滤网过滤掉悬浮液中的团块，离心处理后获得细胞悬液，将其置于4℃冰箱内保存备检，制备106/mL合格单细胞悬液。②于单细胞悬液中加入各蛋白工作液100 μL，在室温条件下孵育30 min，使用10 mL PBS溶液进行稀释，再次行离心操作撇去上层清液，加入各蛋白抗体，用500目不锈钢网过滤，随后加入500 μLPBS液悬浮细胞，调整浓度至106/mL，应用流式细胞仪检测。③应用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，EPICS XL Ⅱ型），10 000个细胞/次，另应用Expo 32 ADC软件行免疫荧光数据分析，测定相关结果。

1.4 观察指标

①分析各组免疫组化检测结果。②分析各组流式细胞检测结果。③分析各蛋白在宫颈癌中表达的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，采用Spearman相关性分析及Kappa一致性检验分析，P<0.05为差异有統计学意义。

2 结果

2.1 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白于各组中的免疫组化检测结果

宫颈癌组Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白阳性率均高于高级别CIN组及低级别CIN组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、封三图3～14。

2.2 Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白FI值比较

正常对照组及低级别CIN组各蛋白FI值比较，差异无统计学意义（P>0.05）;低级别CIN组、高级别CIN组与宫颈癌组Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 相关性分析

Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中均呈正相关，Survivin、Ki67相关性检验显示，r=0.534，一致性检验Kappa=0.512，P=0.006;另Ki67及HPV16-E6蛋白相关性检验显示，r=0.714，Kappa=0.708，P=0.000;Survivin及HPV16-E6蛋白相关性检验显示，r=0.523，Kappa=0.627，P=0.001。

3 讨论

宫颈癌发病机制较为复杂，是多种因素共同作用的结果。研究显示[11-12]，Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白的表达高低与宫颈癌形成间存在密切联系，依据其表达能力的强弱，有助于判断患者病情严重程度，对评估患者预后意义重大。

细胞有丝分裂初期，Survivin在微管动力作用下能够维持正常的有丝分裂秩序，发挥Survivin抑制细胞凋亡的作用[13-14]。另Survivin在血管中具有重要作用，血管形成时，受到生长因子等因素刺激，各细胞不断分裂及重塑，形成原始血管及开放血管，在此过程中若破坏基质与内皮细胞的连接，将对内皮细胞的信号传导造成影响，进而引发血管结构退化[15-16]。Ki67为非组蛋白，具有预测化疗不良反应的作用。由于宫颈癌术前需进行辅助化疗，以通过抑制肿瘤细胞的增殖而达到抑制肿瘤生长或缩小肿瘤体积的目的[17-18]。但在临床应用中并非所有患者均对化疗敏感，若患者对化疗不敏感，于化疗前行Ki67测定，观察其水平是否为高表达，以预测患者对辅助化疗的反应及预后[19-20]。HPV16为HPV中的高危型，Ki67被认为与高危型HPV间联系密切，上述两个指标联用有助于筛查宫颈癌高危人群[21-22]。HPV16-E6蛋白与细胞周期调控蛋白间具有相互作用，能够周期调控及干扰正常细胞运行，促使细胞无限量增殖[23]。相关研究结果显示[24-25]，HPV16-E6阳性组中患者Ki67的免疫细胞数高于其他类型的HPV。故可将Ki67作为诊断CIN不同时期及早期宫颈癌筛查的重要标志。本研究结果显示，宫颈癌组各蛋白阳性率均高于高级别CIN组及低级别CIN组，低级别CIN组、高级别CIN组与宫颈癌组Survivin、Ki67、HPV16-E6蛋白FI值比较，差异有统计学意义，各蛋白在宫颈癌组织中均呈正相关，Ki67及HPV 16-E6蛋白检验相关性及一致性最强，r=0.714，Kappa=0.708。表明Survivin、Ki67及HPV16-E6蛋白参与宫颈癌发生及发展，其中Ki67及HPV16-E6蛋白与宫颈癌发生的联系更加密切，依据其水平变化、相关性、一致性等可有效筛查宫颈癌高危人群，为临床诊疗提供可靠依据。

综上所述，Survivin、Ki67及HPV16-E6联合检测在宫颈癌病变发展过程中相互作用，可将其作为诊断早期宫颈癌的重要指标，为肿瘤预防及预后评估提供重要信息。

[参考文献]

[1] 阎冰冰，金芬，王忠民，等.人乳头瘤病毒在宫颈癌、宫颈癌前病变和宫颈炎症中的水平及其临床意义[J].实用癌症杂志，2018，33（10）：1724-1726.

[2] 刘霞，张乔，张慧杰.人乳头瘤病毒16型DNA整合对宫颈癌变的影响[J].中国现代医学杂志，2020，30（9）：28-33.

[3] 孙静，王晓燕.人乳头瘤病毒在宫颈癌筛查中的价值[J].中国药物与临床，2019，19（15）：2625-2626.

[4] 王晓丹，汤丽荣.高危型人乳头瘤病毒感染与宫颈癌前病变的相关性研究[J].医学研究杂志，2020，49（9）：137-140.

[5] 李桂湖.Survivin、p53在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达及意义[J].中国生育健康杂志，2017，28（3）：280-281，285.

[6] 荫伟.小分子Survivin抑制剂YM155对人子宫颈癌SiHa和ME-180细胞增殖、凋亡的影响及机制研究[J].医学分子生物学杂志，2018，15（5）：320-326.

[7] 唐梅，尤共平，林丽慧，等.EZH2和Ki-67在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J].中国妇产科临床杂志，2018，19（1）：12-15.

[8] 马淑云，雷洁，张欣，等.Ki-67、p16及EGFR表达与老年宫颈癌手术患者预后的相关性[J].中国老年学杂志，2019，39（11）：2635-2639.

[9] 陶志梅，潘敏，俞美娟，等.高危型人乳头瘤病毒感染联合液基薄层细胞检测对宫颈癌及宫颈癌前病变筛查与随访的临床意义[J].中华医院感染学杂志，2017，27（10）：2340-2343.

[10] 柯然利，孙慧儿，喻燕雯.人乳头状瘤病毒分型及肿瘤标志物联合检测在宫颈癌前病变及宫颈癌中的诊断应用分析[J].中国卫生检验杂志，2018，28（12）：1476-1478.

[11] 马天有，归巧娣，施瑞洁，等.RNA干扰抑制HPV16E6基因的表达对HPV16阳性宫颈癌细胞中基因表达谱的影响[J].现代肿瘤医学，2017，25（19）：3058-3063.

[12] 遲龙青，杨薇薇，刘宇，等.宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16-E6基因整合/整合率与临床病理资料相关性分析[J].国际免疫学杂志，2018，41（1）：19-22.

[13] 崔红香.β-catenin，survivin在Ⅰa1～Ⅱa2期宫颈癌中的表达及其临床意义[J].标记免疫分析与临床，2019，26（11）：1879-1883.

[14] 周成友，杜阳，赵静，等.子宫颈癌中miR-153和Survivin的表达及其临床意义[J].临床与实验病理学杂志，2020，36（3）：311-315.

[15] 賈利刚，褚兆苹，田菲，等. XIAP、cyclin D1及survivin在宫颈癌组织中的表达及意义[J].癌症进展，2018，16（10）：1281-1283，1302.

[16] 施璠，汪涛，王娟，等.宫颈癌组织中Survivin、UHRF1 mRNA表达及其与宫颈癌放疗敏感性的相关性[J].西安交通大学学报，2020，41（1）：23-26.

[17] 周静，李智，周玉，等.宫颈癌组织中Ep-CAM和Ki67的表达及临床意义[J].现代检验医学杂志，2019，34（6）：24-27.

[18] 张佳佳，王萍.Scc、CA125和Ki67在宫颈癌和癌前病变诊断中的价值[J].中国生物制品学杂志，2017，30（7）：739-741.

[19] 姚珊瑚，陈宁，刘维娜，等.宫颈脱落细胞Ki67和exportin-5表达用于宫颈癌筛查的初步研究[J].中国卫生检验杂志，2019，29（12）：1427-1430.

[20] 张睿怡，郭红燕，游珂，等.p16INK4a/Ki67免疫细胞化学双染在检出宫颈癌及癌前病变中的作用[J].肿瘤预防与治疗，2017，30（6）：427-432.

[21] 史春，葛菲，温云花.HPV16E6及HPV16E7蛋白在宫颈癌中的表达及临床意义[J].解放军医药杂志，2018， 30（8）：29-32.

[22] 孙丽艳，陶萍萍，杨宾烈，等.宫颈HPV16持续感染阶段宫颈P16和Ki67的表达及其与宫颈癌变的关系[J].现代生物医学进展，2018，18（21）：4103-4106.

[23] 程莹星，黄勇.HPV16-E6-DNA对宫颈癌预后价值分析[J].河北医学，2017，23（12）：1944-1948.

[24] 詹晓芬，王少洪，吴璇，等.HPV E6/E7 mRNA联合P16/ki67免疫细胞化学双染色检测在不典型鳞状细胞（ASCUS）分流诊断中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2018，34（10）：937-941.

[25] 陈飞，任琛琛，杨立，等.HPV E6/E7 mRNA，p16/Ki67检测在ASCUS中的诊断价值[J].现代妇产科进展，2019， 28（1）：54-57.

（收稿日期：2021-09-01）