转cry1Ac基因欧洲黑杨对赤子爱胜蚓生长发育和生殖的影响*

沈文静 张 莉 刘来盘 方志翔 刘 标

(生态环境部南京环境科学研究所 南京 210042)

杨树在我国广泛栽培，杨树天然林在我国18个省区均有分布。据第九次全国森林资源清查，杨树人工林面积为757万hm2，在人工林中排名第2位(曾伟生等， 2019)。杨树人工林物种单一、生物多样性低，病虫害严重，经济损失巨大(吴秋芳等， 2015)。随着生物技术的发展，转抗虫基因植物不仅能够有效控制虫害，还能够减少化学农药的使用，已成为植物抗虫育种的重要手段。2002年，我国研发的转cry1Ac基因欧洲黑杨(世纪杨)(Populusnigra)获得原国家林业局良种审定和商品化许可，成为世界上第一个商品化栽培的转基因林木树种(丁莉萍等， 2016)。

与其他转基因植物一样，转基因杨树的生态安全受到广泛关注，我国2个抗食叶害虫转基因杨树已有一定规模种植，胡建军等(2010)综合相关研究认为转抗虫基因杨树不仅可以有效控制靶标害虫的种群数量, 同时还提高了昆虫类群的多样性, 有利于害虫的综合治理。目前针对转基因杨树生态安全方面研究主要集中在林间昆虫群落的调查分析，对于室内定量分析转基因杨树对非靶标生物，特别是对具有重要生态功能指示物种的影响还少有报道。蚯蚓在土壤生态系统的物质循环和能量流动起着重要作用，能够促进有机质的分解、改善土壤结构和理化性状，并能为土壤中其他生物提供易利用食物，是土壤质量的指示物种(Thakuriaetal., 2009)。赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)在我国主要分布于长江以北，喜欢生活在富含腐殖质和有机质的环境中，黄初龙等(2003)报道赤子爱胜蚓是黑龙江帽儿山森林系统中蚯蚓优势种。由于赤子爱胜蚓易于培养，对毒物响应较为稳定，已成为转基因植物残体对蚯蚓影响研究首选的实验动物。

本研究以转基因杨树叶片为材料，通过室内饲喂赤子爱胜蚓，研究转基因杨树对赤子爱胜蚓生长和发育影响，分析赤子爱胜蚓体内生物酶活性变化趋势，为转基因杨树大规模应用提供生态安全方面的数据。

1 材料与方法

1.1 杨树材料

本试验所用杨树叶片采集于河北省任丘市天门口乡尚书村村西转基因杨树实验林，林地原为平坦农耕地，杨树种植于2004年，株行距5 m × 3 m，转基因杨树品种为转cry1Ac基因欧洲黑杨(世纪杨)，对照杨树品种为2025杨(P.deltoides‘Lux’×P.deltoides‘Shanhaiguanensis’)。2018年11月间，收集仍在枝头的完整的枯黄杨树叶片，自然晾干粉碎后备用。叶片基本理化性质见表1，具体测定方法参照《现代植物生理学实验指南》(中国科学院上海植物生理研究所， 1999)。

表1 杨树叶片基本成分Tab.1 Characteristics of poplar leaf (mg·g-1DM)

1.2 实验动物

供试赤子爱胜蚓种群由本实验室长期养殖，选用1月龄以上、体质量为0.15～0.18 g的健康赤子爱胜蚓作为试验材料。

1.3 试验设计

据报道温带杨桦林年平均凋落量为3.89 t·hm-2，按土层厚度20 cm，土壤密度1.15 g·cm-3计算，每公顷土壤总质量为2 250 t，因此，自然土壤中蚯蚓可能接触转基因杨树残体的最高剂量为1.73 g凋落物/1 kg干土(武启骞等， 2017)。本试验中将赤子爱胜蚓暴露剂量定为40 g凋落叶片/960 g干土，超出其在实际环境中可能暴露剂量的20倍。土壤来自南京周边林地表层土(5～20 cm)，自然风干研磨后过1 mm孔径筛，备用。

本试验设3种处理： 1)转基因杨树组；2)非转基因对照杨树组；3)发酵牛粪组。每个处理均设3个重复。发酵牛粪组中发酵牛粪为本实验室利用新鲜牛粪堆制而成。按照40 g叶片/960 g干土配置凋落物，加入去离子水，使得土壤含水量为30%，搅拌均匀后按每瓶750 g基质(1 L玻璃圆柱形敞口瓶)分装。将蚯蚓随机分组，按每组10条放入敞口瓶中，以纱布封口，放置于(22±2)℃、湿度为80%～85%的培养箱内，持续适量光照(400～600 lx)。

1.4 赤子爱胜蚓生长和繁殖测定

试验共计进行140天，每隔14天观察每个处理赤子爱胜蚓生存状态，记录蚓茧数量，称量赤子爱胜蚓体质量。每次调查后将4 g新叶片或发酵牛粪添加入基质中，混匀充分，再将蚯蚓重新放入敞口瓶中，观察钻洞行为，继续试验。

84天调查时，将检获的蚓茧随同基质放入玻璃培养皿(直径9 cm)，每皿1枚蚓茧，每重复设置10个蚓茧，放入培养箱中，每日观察孵化情况，直至30天。蚓茧孵化第7天，取出幼蚓，每重复取3条合并称重，- 80 ℃保存，用于测定初孵幼蚓体内酶活性。

1.5 外源蛋白和蚯蚓体内生物酶活性测定

分别在试验开始、14天、84天和140天时收集叶片土壤混合基质，- 80 ℃保存。140天结束时，每处理每重复分别取3条成蚓，室温过夜放置清肠后合并称重，收集肠道排泄物； 将蚯蚓低温研磨，加样品提取液，旋转混匀，离心3 min，取样稀释后待测体内酶活性。基质和蚯蚓组织保存、前处理方法参照Shu等(2015)。蚯蚓体内总蛋白、乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)活性使用Sigma公司相关试剂盒测定，外源Cry1Ac含量利用Envirologix公司Cry1Ab/c 蛋白ELISA试剂盒(AP003)测定，具体测定按照试剂盒说明书进行。

1.6 数据处理

用SPSS17进行数据单因素方差分析，Student-Newman-Keuls检验比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 转基因杨树叶片对蚯蚓生存和生长影响

在研究的140天所做的10次调查中，转基因杨树组、非转基因杨树组和发酵牛粪组3个处理存活的赤子爱胜蚓的体征和行为表现正常(无瘦弱、对机械刺激反应敏感)，钻洞行为也未发现异常。在试验进行第42天时，非转基因杨树处理组出现第1例死亡，转基因杨树和发酵牛粪处理组无死亡个体。随着试验的进行，各处理组均出现零星死亡情况，至试验84天时3个处理组均出现死亡个例，随着试验时间增加，各处理组存活率均略有所下降，至试验结束时(140天)转基因杨树组赤子爱胜蚓存活率为86.67%±4.36%，对照杨树组存活率为86.67%±11.55%，两者间无显著性差异(P>0.05)。长期生活在转基因杨树叶片环境中的赤子爱胜蚓，相比对照非转基因杨树，存活情况未受影响。

表2 不同处理组赤子爱胜蚓的存活率Tab.2 Survival rates of E. foetida in different treatments %

每隔14天称量各处理组蚯蚓体质量(图1)，在试验0～84天，每处理组蚯蚓处在发育期，均快速生长，98天后处于平缓期，体质量变化波动不大。10次测定中，转基因杨树和非转基因处理组蚯蚓平均体质量均无显著性差异(P>0.05)。在试验前期，发酵牛粪组蚯蚓体质量增加最快，在42天时体质量显著高于2个杨树处理组(P<0.05)，而随着试验时间的增加，3个处理组体质量差异逐渐变小，到112天时，3个处理组体质量基本相当，表明2个杨树处理组的营养能够满足蚯蚓生长所需。

图1 不同处理组赤子爱胜蚓体质量变化Fig. 1 Average weight of E. foetida in different treatments不同小写字母表示同一调查点的不同处理在0.05水平上差异显著。下同。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level among the three treatments in the same time. The same below.

2.2 转基因杨树叶片对蚯蚓繁殖的影响

在本试验的第28天，3个处理组赤子爱胜蚓均开始繁殖，在叶片土壤混合基质中发现蚓茧，在28～140天共计9次调查中，发酵牛粪组产茧数有7次高于转基因杨树和非转基因组，其中56天时显著高于2个杨树处理组(P<0.05)(图2)。转基因杨树组和非转基因杨树组在各调查期蚓茧数产量趋势一致，在绝大部分时期数值接近且均无显著性差异，仅在70天时非转基因杨树组蚓茧数显著高于转基因杨树组，结合56天和84天转基因杨树组蚓茧数高于非转基因杨树组，推测是蚯蚓繁殖的生理波动。统计整个试验期各处理总繁殖蚓茧数，发酵牛粪组为(104.33±6.60)个，转基因杨树组为(87±2.62)个，非转基因杨树组为(90.33±3.41)个，转基因杨树和非转基因杨树组无显著性差异(P>0.05)。

图2 不同处理组单条蚯蚓平均产茧数Fig. 2 Average cocoon numbers in different treatments(per earthworm)

由于蚓茧孵化周期较长，每隔14天将蚓茧移除试验体系，因此在140天式验中，未在混合基质中检获到新生幼蚓，利用84天检获的蚓茧，调查了3个处理组蚓茧孵化率和平均每茧新生蚓数量，结果显示蚓茧孵化率和每茧新生幼蚓数量均为发酵牛粪处理组最高，但蚓茧孵化率和每茧新生幼蚓数量在3个处理组间均无显著差异(表3)。和非转基因杨树相比，转基因杨树未对赤子爱胜蚓蚓茧内受精个体数量和蚓茧孵化率产生不利影响。

表3 不同处理组蚓茧孵化的情况①Tab.3 Cocoon hatchability in different treatments

2.3 转基因杨树叶片处理下赤子爱胜蚓解毒抗氧化酶等生化酶活性变化

在成熟蚯蚓140天试验结束后，各处理组赤子爱胜蚓的体内总蛋白、SOD、GST和AchE酶活性均无显著差异。刚孵化7天幼蚓体内总蛋白、GST和AchE活性在3个处理组间无显著性变化，但转基因杨树组和非转基因杨树组SOD酶活性显著高于牛粪组(P<0.05)(表4)。

表4 各处理组蚯蚓体内总蛋白和生化酶活性变化Tab.4 The total protein content， and activities of AchE, GST and SOD in earthworms in different treatments

2.4 叶片土壤混合基质中和赤子爱胜蚓体内外源Cry1Ac蛋白含量

在0、14、84和140天测定转基因杨树处理组叶片土壤混合基质中外源Cry1Ac蛋白的含量。表5表明Cry1Ac蛋白在混合基质中快速降解，14天含量仅为初始含量61.92%，84天和140天混合基质中外源Cry1Ac蛋白含量分别为试验开始剂量的43.32%和35.94%，同时140天时蚯蚓肠道排泄物也检测出Cry1Ac蛋白。因此每次调查后继续向试验体系中添加新的基质(叶片碎片和发酵牛粪)是必要的，保证了受试赤子爱胜蚓处在转基因杨树叶片和外源蛋白环境中，同时又是蚯蚓物质能量来源。试验结束后，赤子爱胜蚓全组织匀浆液中未检测到外源蛋白的存在，可以认为长时间暴露在高含量转基因杨树叶片的环境中，外源Cry1Ac蛋白不会在赤子爱胜蚓体内蓄积。

表5 转基因杨树叶片处理组中不同材料外源Cry1Ac蛋白含量Tab.5 Amounts of exogenous Cry1Ac protein in different samples in treatments of transgenic poplar leaves

3 讨论

我国转基因林木育种一直走在世界前列，已有2个转Bt基因杨树品系获得商品化生产许可，并已推广一定面积(胡建军等， 2010)。转基因林木一般为多年生树木，种植环境和管理措施与转基因作物截然不同，可以预见，进入土壤生态系统的转基因林木凋落物总量和影响时间将远远大于转基因作物。转基因植物对蚯蚓等土壤生物影响已成为转基因植物环境安全评价的重要方面，转基因作物对蚯蚓影响已有较多的报道，大部分报道显示不论是以Bt蛋白还是以转基因作物残体饲喂蚯蚓，对成蚓生长、繁殖均无显著不利影响(肖能文等, 2005; Clarketal., 2006； Schraderetal., 2008； 刘凯等, 2015)。Zeilinger等 (2004)调查了长期种植转基因玉米(Zeamays)的美国西部农田中蚯蚓种群，发现蚯蚓种类、密度和年龄结构并未受到不利影响。但并不是所有研究均表明转基因植物对蚯蚓无不利影响，van der Merwe等(2012)报道转基因玉米对蚯蚓的繁殖无显著影响，但成蚓体质量显著降低。Li等(2019)报道从幼蚓阶段就饲喂转Bt水稻(Oryzasativa)秸秆对赤子爱胜蚓生长、繁殖无影响，幼蚓的性成熟期缩短； 但发育成熟赤子爱胜蚓再暴露在转Bt水稻秸秆中对其体质量和产茧量均有不利影响。有研究发现，赤子爱胜蚓长时间多代暴露在转Bt基因玉米秸秆中，各世代受到影响不同且变化巨大，第1代为不利影响，第2代无影响，第3代变为有利影响(Shuetal., 2015)。这些结果说明外源基因类似的不同转化事件对蚯蚓影响具有多样性，应该根据个案评价原则进行具体研究。本研究中设置较高含量杨树叶片，约为年进入土壤量的20倍，在如此高浓度下，相对非转基因杨树，饲喂转cry1Ac基因杨树叶片的赤子爱胜蚓在生长和繁殖方面无显著差异，说明转cry1Ac基因杨树对赤子爱胜蚓的生长繁殖无不利影响。

蚯蚓幼蚓生长迅速、代谢旺盛，对环境中不利因素高度敏感，但因蚓茧孵化时间不一、手检时易损伤等原因，转基因植物对初孵幼蚓的影响还无深入研究，目前研究方法主要为调查某一处理阶段幼蚓总数，或待初孵幼蚓生长发育一段时期后再研究后续生长发育影响(Rickettsetal., 2004; Vercesietal., 2006)。本研究通过单茧孵化的方法，研究了转cry1Ac基因杨树处理下蚓茧孵化率，并对幼蚓(孵化7天)体内解毒抗氧化酶活性进行测定，结果表明转基因杨树与非转基因杨树处理在这些指标上均无显著差异。但幼蚓7天暴露中2个杨树处理组SOD活性显著高于发酵牛粪组，而140天成蚓体内SOD酶活性在3个处理组间无显著差异。刘海涛等(2010)提取了与本研究相同材料的转基因杨树和非转基因杨树叶片浸提物，发现在高浓度条件下2种杨树提取物对胡萝卜(Daucuscarota)和白菜(Brassicachinensisvar.communis)幼苗生长均有一定抑制作用。化感物质进入土壤后会直接毒害及抑制土壤动物活动，如巨桉(Eucalyptusgrandis)人工林凋落物浸提液对赤子爱胜蚓生长和生理指标均有显著不利影响(Zhuetal., 2011; 余俊里等, 2017)。笔者推测是杨树叶片中化感物质影响幼蚓SOD活性，成蚓长时间暴露后逐渐适应而未显示出差异。先前研究转基因棉花(Gossypium)对赤子爱胜蚓SOD酶活性影响时也表明转基因棉花和亲本棉花处理组SOD活性显著高于发酵牛粪处理组，但两者间无显著性差异(Liuetal., 2009; 丁帅等, 2012)。

实质等同性原则是转基因生物安全评价的基石，这要求在试验设计时要设置转基因植物的亲本或者同类对照，对照亲本材料作用是排除植物自身等干扰因素，保证结果的准确性，本研究中推测杨树叶片中的化感物质会对蚯蚓体内SOD产生影响，如果非转基因杨树材料在酚类化感物质上与转基因杨树差异较大，就会影响试验结果，因此转基因植物对环境安全影响监测特别是对非靶标生物毒性研究需考虑转基因组和非转基因对照组两者遗传和性状背景一致性。目前转基因生物对非靶标生物影响的研究中均设置了非转基因对照组，但部分研究未设置正常试验饲养条件下常规组。与化学品等有毒性物质不同，转基因植物对非靶标生物影响程度低，可能需要长期多代观察，这要求在试验设计时必须考虑在满足暴露剂量的条件下受试生物的营养需求和环境条件，全面丰富的营养、适合环境是受试生物正常生长繁育的关键。当营养和环境需求不能够满足时，转基因组和非转基因对照组正常生理代谢活动特别是生长和繁殖指标均会受到胁迫，会掩盖转基因植物对非靶标生物可能影响。本研究中设置了发酵牛粪常规对照组，发酵牛粪的营养成分和可利用率好于杨树叶片，发酵牛粪组赤子爱胜蚓的体质量和产茧数均要高于2个杨树处理组，140天时转cry1Ac基因杨树组和非转基因杨树组体质量为发酵牛粪组的91.16%和93.69%，整个试验期转基因杨树组和非转基因杨树组总繁殖蚓茧数为发酵牛粪组的83.65%和86.85%。本研究中的试验体系基本满足蚯蚓正常生长和繁殖需求。为了避免营养和环境需求不能够得到满足而导致的试验误差，建议在转基因植物对非靶标生物影响评价过程中均应设置常规对照组。

4 结论

经过140天的饲喂试验初步表明，相对非转基因杨树，转cry1Ac基因欧洲黑杨(世纪杨)对赤子爱胜蚓的存活、生长(体质量变化)、繁殖(产茧量和孵化情况)、体内生化酶活性(AchE、SOD和GST)无显著影响。赤子爱胜蚓长时间取食转基因杨树叶片，没有发现外源Cry1Ac蛋白在蚯蚓体内蓄积，表明转cry1Ac基因欧洲黑杨对蚯蚓是安全的。