包虫病特异性抗体检测试剂盒诊断效能评价及结果判定优化

杨柳莹 陈曦阳 凌 攀 杨 烨 孙 黎

(1.四川省疾病预防控制中心，四川成都 610041；2.成都生物制品研究所有限责任公司，四川成都 610023)

包虫病是棘球蚴寄生于人体和动物组织所致的寄生虫病，主要以肝脏占位病变为主，也可累及肺、脾、肾等多个器官。该病对人类的危害性大，早发现易治疗，晚期致死率较高(中国医师协会外科医师分会包虫病外科专业委员会，2019)。由于该病早期症状不明显，临床上容易误诊漏诊。无创伤辅助检查主要以影像学确认其特征性病灶为依据，但该方法不能发现早期感染患者且因部分包块影像缺乏特异性，与肿瘤等病灶相似而难以区分(陈刚等，2000；戴季蓬等，2011；Zhangetal., 2012；阁文心等，2020)。人体感染包虫后，相应特异性抗体的产生成为最早出现的诊断依据。因此，免疫学诊断可弥补影像学检查的缺陷，在包虫病早期诊断、筛查无症状感染患者、复杂疑难疾病治疗如手术病人术前风险评估中具有较为重要的临床参考价值(陈小林等，2011；Tameretal，2015)。

目前，国内大多数包虫病特异性IgG抗体诊断试剂盒还处于科研阶段，仅有3个厂家的试剂盒在2011年后依次得到国家药品监督管理局(NMPA)的批准予以上市。各厂家选用的特异性抗原、制备试剂的工艺流程均有一定区别，其检测性能也有所差异，因此本文为了解目前市面上包虫病试剂盒的诊断水平，对该3种试剂盒临床诊断效能进行评价，以期为包虫病临床诊断提供试剂盒检测结果优化判定的策略。

1 材料与方法

1.1 试剂

包虫病抗体诊断试剂盒(新疆贝斯明DIGFA，批号：20200307；上海新吉而GICA，批号：20200523；珠海海泰ELISA，批号：20200406)。

1.2 标本来源

收集2010年至今四川省疾病预防控制中心门诊就诊病人血清。囊型包虫病人血清69份和泡型包虫病人血清18份，排除囊型泡型包虫混合型感染病例。四川省进藏援建排查人员血清25份。影像呈占位性病变经诊断排除包虫感染者25份，其中18份为肝占位病人血清。寄生虫专科囊虫确诊病人血清10份，排除包虫囊虫混合感染病例。肝吸虫、肺吸虫、血吸虫病人血清各6份。

1.3 方法及结果判定

采用3种试剂盒严格按照SOP进行操作，同时检测所有样本血清，并记录结果。具体检测方法及结果判定规则见参考文献(房彬彬等，2019；庞华胜等，2019)。为优化检测效能，提高方法的特异度。本研究将DIGFA法的检测结果划分为6级，出现对某种抗原呈反应性时相应检测点显色：0级为对4种抗原均无反应性，1级为对EgCF或EgP中一个抗原呈反应性，2级为对EgCF和EgP两种抗原呈反应性，3级为对其中两种抗原呈反应性且其中一种必为EgB或Em2，4级为对任意3种抗原呈反应性，5级为对4种抗原均呈反应性。将GICA法的检测结果划分为6级：0级为检测线1无色(-)，1级为有隐约痕迹(±)，2级为浅红色(+)，3级为红色(++)， 4级为深红色(+++)， 5级为紫红色(++++) 通过ROC曲线对检测结果进行分析，并寻找最佳诊断界值。采用DIGFA法对ELISA法或GICA法所得检测结果低于相应最佳诊断界值的阳性样本进行重新测定，以DIGFA法最佳诊断界值为结果判定标准，比较结果优化前后检测效能指标差异。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0进行数据分析，结果用Kappa值进行一致性评价；通过ROC曲线进行试剂盒诊断效能评价，确定最佳诊断界值。

2 结果

2.1 3种包虫病抗体检测试剂盒针对相同样本的检测结果

各试剂盒针对包虫病人血清样本的检测结果存在漏检。各类非包虫病排查人群均出现包虫病抗体假阳性结果，在囊虫病人血清中的包虫病抗体假阳性率最高，在其他不同人群中包虫病抗体假阳性率无规律可循。结果详见表1。

2.2 胶体金法针对两型包虫病的鉴别能力

3种试剂盒中只有使用胶体金法的两种试剂盒具有判别囊型、泡型包虫病的能力。DIGFA法用于检测的4种抗原中，EgB或Em2单抗原对包虫病的敏感度明显低于EgCF或EgP抗原。Em2和EgB抗原检测点同时呈反应性共43例，两抗原对包虫病人血清敏感度仅为74.7%(65/87)，低于该试剂盒对所有包虫病人血清的敏感度90.8%，且存在假阳性结果。GICA法HCF和rEm18抗原检测线同时呈反应性共15例。针对检测泡型包虫病的rEm18抗原敏感度为94.5%，特异度为100%。结果详见表2、3。

表1 不同组病例3种包虫病抗体诊断试剂盒对应的检测结果Tab.1 Results of the three kinds diagnostic kits for echinococcosis antibody in different human groups

表2 2种胶体金法包虫病抗体试剂盒鉴别两型包虫病诊断效能比较Tab.2 Diagnostic efficacy of two colloidal gold antibody kits for two echinococcosis

表3 DIGFA法各抗原包虫病检测效能比较Tab.3 Detection efficacy of echinococcosis antigens by DIGFA

2.3 ROC曲线寻找各法最佳诊断界值

ROC曲线所得最佳诊断界值即各曲线上离坐标轴上点(0.0,1.0)最近时所对应的值。GICA.DIGFA.ELISA法所获得ROC曲线见图1，ROC曲线下面积分别为0.938、0.901、0.945，试剂诊断准确性较高，0.9

图1 3种诊断方法检测数据所对应的ROC曲线Fig.1 ROC curves corresponding to the data detected by three diagnostic methods

2.4 方法优化前后检测效能比较

3种检测方法中GICA法的灵敏度最佳为94.3%，ELISA法的特异度最好仅为83.3%。Kappa值显示3种方法诊断结果的一致性水平均为“好”，0.6

表4 三种诊断方法最佳诊断界值对应的检测效能Tab.4 Detection efficacy corresponding to the best diagnostic cutoff values of three diagnostic methods

表5 优化前后的检测效能Tab.5 Improved detection efficacy after optimization

3 讨论

包虫病属于地方病，在我国患病率并不高(Zhangetal., 2015)，就诊排查人群中绝大部分为非包虫病人。本中心不仅对疑似包虫病的患者进行检查，近年来还承接各政府部门派遣至藏区工作至少1年以上人员的包虫病排查工作(邓银等，2020)。筛查对象不断增加，而最终确诊人数较少，方法特异度差引起的误诊给病人带来心理负担以及药物对身体的伤害，造成医疗资源的浪费。抗体筛查作为包虫病辅助诊断的重要一环，使用敏感度强、特异度高的诊断试剂，实现尽早发现病人，减少不必要的诊疗具有重要的意义。

各方法的诊断效能指标均表现良好，仅特异度不理想，因此本室通过ROC曲线寻找各法的最佳诊断界值，发现其均高于试剂盒的cutoff值，该界值对应的灵敏度在81.6%～83.9%之间，特异度在89.7%～92.3%之间。在日常检测工作中发现，通过ELISA法或GICA法检测到的假阳性样本中，反应性较弱的样本血清通过DIGFA法检测仅出现其中1～2个检测点显色的情况较多。而包虫病人血清即使ELISA法或GICA法检测结果为弱阳性，DIGFA法也可能出现2个以上检测点显色。由此推测包虫病人血清即使抗体浓度不高也可呈现几种抗原同时阳性，而非包虫病人引起的假阳性反应通常在较强时才会出现几种抗原同时阳性。3种方法假阳性结果中，一致性为63.16%(12/19)，重复性较高。经以上观察进行权衡分析，本文对结果判定进行优化，特异度得到改善，结果令人满意。需注意的是GICA法检测泡型包虫病准确度已达较高水平，使用该法判定为泡型包虫病的结果不需要结果优化。

在包虫病分型鉴别诊断中，DIGFA法并不能将检测为阳性结果的所有包虫病人血清进行分型。泡型包虫病假阳性结果中，有2例囊型包虫病人血清Em2抗原反应性强于EgB抗原，这与付艳等研究吻合：个别多子囊型包虫病人对Em2抗原反应性强于EgB抗原(付艳等，2000)。因此Em2反应性强于EgB抗原时，不能排除囊型包虫病的可能。GICA法能对所有检测为阳性结果的包虫病人血清进行分型，且无泡型包虫病假阳性病例，不存在泡型包虫病的误判。在分型鉴别诊断上，两法灵敏度相差较大，GICA法明显优于DIGFA法。

在检测方法的选择方面，由于ELISA法不能对包虫病分型，但具有批量检测的优势，可通过仪器自动化检测，人为干扰因素少，且样本检测单价相对低廉，适于规模性寄生虫病体检筛查。而GICA法能对包虫病分型，操作简单、耗时短，对实验室仪器设备要求低，但结果判断仅凭肉眼观测，易受人为干预，需有经验的检测人员进行判别，且试剂盒价格相对偏高，更适用于医院零散病人的检测。因此，对于不需分型的包虫病筛查，可选用ELISA法。若需分型诊断，则最好选用GICA 法。对于上述两法检测结果介于最佳诊断界值与cutoff之间的样本联合DIGFA法综合判定。考虑到成本效益最大化，工作中不可能对所有病例均进行多试剂同时检测，本研究通过ROC曲线确定的最佳诊断界值，筛选出特定的血清抗体反应性较弱人群采用双试剂盒检测，有效控制成本，可进一步排除其中的假阳性结果，相比于单试剂检测具有更佳的检测效能。

目前市售试剂盒存在的优缺点主要体现为：GICA法检测泡型包虫病人血清抗体使用的rEm18抗原为重组抗原，不易受非目标物质干扰。而3种方法使用的其他抗原均为纯化的细粒棘球蚴抗原，易受非目标物质干扰，特别是因为与其他蠕虫类寄生虫拥有共同的抗原成分的问题，导致与囊虫病人较为严重的交叉反应(仝德胜等，2013；陈闯等，2017)；DIGFA法各单抗原检测抗体的灵敏度相对偏低，联合多种抗原检测抗体增加了试剂的灵敏度，但特异度有所下降；由于囊型或泡型包虫病人阳性血清对两种胶体金法使用的抗原均存在交叉反应，故不能明确患者是否被囊型和泡型包虫混合感染，这与庞华胜等人的报道一致(庞华胜等，2019)。综合以上信息，研制高纯度的重组抗原是今后试剂盒改良的主要方向。如何更好地结合抗体浓度与种类来综合判定结果也是提高试剂盒检测效能的方法之一。解决各特异性抗原与阳性血清之间的交叉反应这一难题可减少分型诊断的误判，更能为囊型和泡型包虫病混合感染病例的确诊提供依据。