海氏肠球菌IDO5对猪粪废水中吲哚降解条件优化及降解途径分析

余琴 马现永 邓盾 王永飞

（1. 暨南大学生物工程学系，广州 510632；2. 广东省农业科学院动物科学研究所 畜禽育种国家重点实验室 农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室 广东省动物育种与营养公共实验室 广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州 510640）

吲哚又名苯并吡咯，是一种存在于自然界中的氮杂环芳香族化合物［1］。吲哚及其衍生物是一种重要的化工原料，被广泛应用于医药、农药、印染等行业［2］。在医药业，吲哚衍生物具有抗炎性、抗菌性、以及抗肿瘤性等生物活性，如双吲哚类药物具有抗菌抗炎的作用，而吲哚美辛类药物具有抗肿瘤作用［3-4］；在农业中，吲哚类植物激素被用来刺激植物生物和促进植物繁育，如吲哚乙酸、吲哚丁酸等［5］；在印染行业，吲哚是吲哚菁、靛蓝等染料的合成底物［6］。可见，吲哚及其衍生物有多种功能，但在服务工业生产和人类生活的同时，环境中也产生了大量吲哚废弃物，其中焦化废水吲哚含量范围为2.6-5.4 mg/L［7］，而制药企业废水中吲哚含量可高达 133.3-150.9 mg /L［8］。

然而相对工业中吲哚污染问题，农业废弃物中吲哚污染问题常常被人忽略。实际上许多农业废弃物中含有较多吲哚，特别是养殖废弃物中吲哚的含量，其浓度通常可达到0.03-0.13 mg/L［9］。虽然其浓度小于工业废弃物，但是由于农业废弃物规模十分庞大，其总量仍十分巨大。据农村农业部统计，我国每年畜禽粪污产生量高达38亿t，据此测算残留的吲哚量最高可达4.94×105kg［10］。这些吲哚及其衍生物的存在不仅影响人类健康也严重破坏生态平衡［11］。高浓度的吲哚及其衍生物可向生物体内聚积，对动植物和微生物都有毒害作用［12-13］，其主要的毒性表现在：加速肿瘤的形成和扩散并具有遗传毒性效应［14］；可以引起肠道炎症、贫血、溶血反应和血红蛋白尿性肾病等疾病［15］；干扰微生物蛋白质表达和引起微生物DNA损伤，抑制微生物的生长［16］。吲哚属于含氮芳烃，被认为是一类难以根除的有毒环境污染物。目前对于此类化合物的去除主要有物理化学法和生物转化法两类［17］。物理化学法，包括超声波法、臭氧氧化等，虽然物理化学法具有较好的吲哚去除效率，但是运行费用高、能耗大，且会产生毒性更大的持久性有机污染物，对于二次污染的治理，无疑又增加了治理费用［18］。而微生物转化在吲哚污染系统修复中具有高效、价廉且环境友好的特点，被广泛用于环境污染物的处理中［19］。

虽然近年来吲哚的生物降解得到了比较深入的研究，但菌种资源还较少，并且研究重点大多为吲哚降解中间产物的鉴定及降解途径的推测，而目前已报道的能降解吲哚的微生物主要有假单胞菌（Psedomonas）、产碱杆菌（Alcaligenes）、贪铜菌（Cupriavidus）和伯克霍尔德菌（Burkholderia）等［20］。通过对上述菌属吲哚的降解途径进行总结，靛红和邻氨基苯甲酸是吲哚降解途径中重要的中间产物［21］。然而前期对吲哚降解的分子机制研究一直尚不明确，直到2017年，Sadauskas等［22］首次报道了不动杆菌Alcaligenes sp.O153在吲哚加氧酶（iif基因簇）的作用下生成邻氨基苯甲酸，后来Qu等［23］通过对贪铜菌Cupriavidus sp.SHE研究发现吲哚在吲哚加氧酶IndA作用下生成靛红，由此为微生物降解吲哚分子研究打下基础。

不同吲哚好氧降解菌的吲哚去除速率有一定差异，Alcaligenes sp. YBY在12 h内能完全降解100 mg/L吲哚，达到目前报道的最高降解效率［17］，然而大多数的吲哚降解菌至少需要1-36 d的时间才能完全降解100 mg/L吲哚［20］。此外，将吲哚降解菌株直接应用于猪粪吲哚降解的研究较少，其降解效果也不够高效，如邵栓等［24］将猪粪中筛选得到的克雷伯氏菌（Klebsiella）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）等菌分别直接作用于猪粪，吲哚的去除率最高只能达到59.12%，因此利用微生物直接降解猪粪水中吲哚仍需要进一步研究。在前期的研究中，我们发现了一株高效的吲哚降解菌株IDO5，本文研究了其直接降解猪粪中吲哚的能力，并探讨了菌株降解吲哚可能的途径，以期望对用微生物降解养殖废水中吲哚污染物提供一定的参考和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料

吲哚标准品购自上海佰晔生物科技中心，色谱级乙腈、色谱级甲醇购自上海阿拉丁试剂有限公司，其余试剂均为国产分析纯，购自生工生物工程（上海）。使用的主要仪器：恒温培养箱，高速低温冷冻离心机（Multifuge-X1R 美国 Thermo），高效液相 色 谱 仪（high-performance liquid chromatography，HPLC）（Waters E2695 美国 Waters），三重四级杆气质联用仪（triple quadrupole gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）（TQ8040 日本岛津企业）。

用于吲哚降解实验的无机盐培养基（MSM）配方（g/L）：Na2HPO4·12H2O 3.28，（NH4）2SO42.0，KH2PO42.0，FeCl30.000 25，pH自然，1×105Pa，灭菌20 min；用于菌株培养的LB培养基配方（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.3，琼脂粉10.0（固体培养基），1×105Pa灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌体形态观察 将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，200 r/min培养24 h备用。取2 mL菌液，8 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入戊二醛水溶液（2.5%）固定2 h，然后用乙醇梯度脱水（30%、50%、70%、90%、95%、100%），最后临界点干燥和离子溅射金后用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察菌株IDO5的细胞形态。

1.2.2 菌株16S rRNA基因序列测定 利用菌株IDO5的DNA作为模板，以16S rRNA基因的通用引物作为扩增引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′； 下 游 引 物1492R ：5′-GGTTAC- CTTGTTACGACTT-3′。 对 菌 株IDO5的16S rRNA基因进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μL，包括DNA模板1 μL，上游引物27F 2 μL，下游引物 1492R 2 μL，Taq 酶 0.8 μL，20 μmol/L dNTP 4 μL，10×Buffer缓 冲 液 5 μL， 无 菌 ddH2O 35.2 μL。PCR克隆扩增程序：94℃预变性10 min，30个循环（94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s），最后72℃延伸5 min。PCR完成之后，将扩增产物进行胶回收并送公司测序。

1.2.3 吲哚检测 取10 mL甲醇至5 mL吲哚反应体系中，充分震荡混匀，混合液经0.22 μm有机系滤膜过滤注射到进样瓶中。采用高效液相色谱-光化学反应器-荧光检测器（high performance liquid chromatography-photoelectric reactor-fluorescence detector，HPLC-PHR-FLD）完成吲哚的检测。色谱条件：色谱柱为XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈∶水=60∶40（V/V），流速1 mL/min，柱温35℃，洗脱时间15 min，荧光激发光波长270 nm，发射光波长350 nm。

1.2.4 菌株IDO5的底物谱 将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，200 r/min培养24 h备用。取上述菌液2 mL到离心管中，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL无机培养基中，分别加入吲哚类似物5-溴二氢吲哚（5-bromoindoline）、3-甲 基 吲 哚（3-methylindole）、2-甲基吲哚（2-methylindole）、色氨酸（tryptamine）和常见的芳香族化合物对甲酚（p-Cresol）和苯酚（phenol）为碳源（100 mg/L），研究菌株IDO5的底物谱。反应条件：温度37℃，转速200 r/min，pH 7，反应24 h。以吲哚为唯一底物的实验组作为对照，所有实验设置3个重复。

1.2.5 菌株IDO5降解猪粪废水吲哚条件的优化 猪粪废水采自与广东省农业科学院动物科学研究所动物养殖基地，猪粪废水高压灭菌后，4℃储存备用，用于考察不同条件对IDO5降解吲哚的影响。将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，200 r/min培养24 h备用，按照以下条件优化猪粪废水中吲哚的降解条件。

1.2.5.1 温度 取1 mL菌液到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL猪粪废水中，分别在温度为20℃、30℃、37℃、40℃和50℃下研究不同温度对菌株IDO5降解吲哚的影响。反应条件：转速200 r/min，pH 7，反应24 h。所有实验设置3个重复。

1.2.5.2 转速 取1 mL菌液到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL猪粪废水中，分别在转速为 0、50 r/min、100 r/min、170 r/min、200 r/min和250 r/min下研究不同转速对菌株IDO5降解吲哚的影响。反应条件：温度37℃，pH7，反应24 h。所有实验设置3个重复。

1.2.5.3 pH 取1 mL菌液到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL猪粪废水中，分别在pH 3、pH 5、pH 7、pH 9和pH 11下研究不同pH对菌株IDO5降解吲哚的影响。反应条件：温度37℃，转速170 r/min，反应24 h。所有实验设置3个重复。

1.2.5.4 碳源 取1 mL菌液到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL猪粪废水中，分别加入葡萄糖（glecose）、酵母提取物（yeast extract）、柠檬酸钠（sodium citrate）和色氨酸（tryptophan）研究不同碳源（100 mg/L）对菌株IDO5降解吲哚的影响。反应条件：温度37℃，转速170 r/min，pH 9，反应24 h。以吲哚为唯一底物的实验组作为对照，所有实验设置3个重复。

1.2.6 不同时间下菌株IDO5对猪粪废水中吲哚的降解能力 将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，200 r/min培养24 h。取上述菌液1 mL到离心管中，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，加入10 mL上述猪粪废水中，震荡摇匀。反应条件：温度37℃，转速170 r/min，pH 9，反应24 h。每隔4 h取样，对样品进行萃取和液相分析。以不加菌的实验组为对照，所有实验设置3个重复。

1.2.7 不同浓度吲哚对菌株IDO5降解能力的影响 向猪粪废水中添加终浓度为100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的吲哚，将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，170 r/min培养24 h备用，取上述菌液1 mL到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到10 mL猪粪废水中。反应条件：温度 37℃、pH 9、转速170 r/min，反应24 h，每4 h取样，对样品进行萃取和液相分析。所有实验设置3个重复。

1.2.8 菌株IDO5降解吲哚产物分析 将菌株IDO5接种到灭菌后的100 mL LB培养基中，37℃，170 r/min培养24 h备用。取4 mL菌液到离心管，4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，取沉淀到5 mL MSM培养基中，加入10 mg/mL吲哚50 μL（反应体系终浓度100 mg/L），在菌株IDO5降解吲哚的0 h，10 h和24 h分别取样，取10 mL乙酸乙酯至5 mL吲哚反应体系中，充分震荡混匀，取上层有机相经0.22 μm有机系滤膜过滤注射到进样瓶中。采用三重四级杆气质联用仪（triple quadrupole gas chromatographymass spectrometry）完成吲哚及其降解产物的检测。色谱条件：色谱柱为DB-5MS（30 m，0.25 mm，0.25 μm），柱温60℃，离子源温度为230℃，接口温度为250℃。采用不分流恒定线速度进样，升温程序：60℃保持5 min后每分钟升温5℃-80℃，之后每分钟升温10℃-290℃，最后保持5 min。采集方式Q3 scan，间隔时间为0.3 s。

2 结果

2.1 菌体形态和菌株16S rRNA基因测序鉴定

从实验室筛选而来的一株能以吲哚为碳源生长的菌株，命名为IDO5。菌株IDO5在LB固体培养基上的菌落形貌如图1-A 所示，菌落呈白色圆点状，为点状凸起，边缘整齐，表面光滑易挑起。通过扫描电镜观察，如图1-B所示，菌株呈链球状，长度约5 μm，无鞭毛。将菌株IDO5的16S rRNA基因序列在GenBank数据库进行同源性比较，结果表明，菌株IDO5的16S rRNA基因序列与海氏肠球菌（Enterococcus hirae）菌属的相似性高达99%，通过MEGA7.0处理分析后构建了系统发育树，IDO5与E.hirae聚为一类（图2），结合形态学特征，将菌株IDO5鉴定为海氏肠球菌（E.hirae）IDO5。

图1 IDO5形态学特征Fig. 1 Morphological characteristics of IDO5

图2 IDO5-16S rRNA系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of IDO5

2.2 IDO5对吲哚和吲哚类似物的降解能力

实验初步测定了菌株IDO5对100 mg/L吲哚的降解能力。图3为对照组和菌株IDO5在吲哚-MSM（100 mg/L）中分别培养12 h和24 h后用HPLC测定的吲哚含量，吲哚的HPLC出峰时间为11.3 min。由图3可知，在以吲哚为碳源的情况下，随着反应时间的延长吲哚的峰面积不断减少，12 h的降解率为44.4%，24 h后的降解率为93%。

图3 IDO5菌液处理吲哚及对照的HPLC结果Fig. 3 HPLC results of treated indole by IDO5 bacterial solution and control

实际上的养殖和工业废水中还可能包含有多种污染物，实验比较了菌株IDO5利用5-溴二氢吲哚（5-Bromoindoline）、3-甲 基 吲 哚（3-Methylindole）、2-甲基吲哚（2-Methylindole）、色氨酸（Tryptophan）和常见的芳香族化合物对甲酚（p-Cresol）、苯酚（Phenol）的能力。由表1可知，除吲哚外，菌株IDO5对上述物质均有一定的降解能力。对吲哚类衍生物5-溴二氢吲哚、3-甲基吲哚、2-甲基吲哚和色氨酸的降解率分别为39%、70%、33%和67%。对甲酚和苯酚的降解率也60%和74%。菌株IDO5能够对常见的吲哚类衍生物质和苯环类物质均有降解能力，说明菌株IDO5具有较广的底物谱。

表1 菌株IDO5的底物广谱性Table 1 Substrate spectrum of strain IDO5

2.3 不同条件下菌株IDO5降解猪粪废水中吲哚的效率

2.3.1 温度 实验比较了20-50℃范围内，温度对IDO5降解吲哚效率的影响。由图4可知，不同温度条件下，菌株IDO5都具有较强的吲哚降解能力。在20℃时IDO5对吲哚的降解率最小，为54.6%，在37℃条件下，IDO5对吲哚的降解率最大，为77.5%，在温度为50℃时，IDO5对吲哚的降解率还有61.0%。因此总体而言，菌株IDO5在20-50℃范围内吲哚降解率都能达到54.6%以上，说明IDO5具有较强的温度适应能力。

图4 温度对IDO5降解猪粪废水中吲哚的影响Fig. 4 Effects of temperature on the degradation of indole in pig anure wastewater by IDO5

2.3.2 转速 转速对IDO5降解吲哚的效率有较大影响。由图5可知，在静止的情况下，IDO5对吲哚的降解率仅为17.6%；在50-170 r/min范围内转速越高，吲哚降解率越高，在170 r/min能达到80.3%；当转速达到250 r/min时，吲哚降解率反而有所下降，只有45.7%。因此IDO5降解100 mg/L吲哚最佳的转速为170 r/min，降解率可达80.3%。

图5 转速对IDO5降解猪粪废水中吲哚的影响Fig. 5 Effect of rotating speed on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

2.3.3 pH 本研究比较了不同pH对IDO5降解吲哚效率的影响。由图6可知，接种24 h后，pH为3-7时吲哚降解率由55.7%-75.5%范围内逐渐升高，pH为11时菌株对吲哚的去除率可达88.3%，而pH为9时降解速率最高，为93.7%，说明菌株不仅在碱性环境下具有更强的吲哚降解性质，而且在酸性范围内也能保持较好的吲哚降解活性，具备较高的pH适应能力。

图6 pH对IDO5降解猪粪废水中吲哚的影响Fig. 6 Effect of pH on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

2.3.4 外加碳源 比较了4种不同碳源对IDO5降解吲哚效率的影响。由图7可知，加入其它碳源后，菌株的吲哚降解能力均呈下降态势，其中柠檬酸钠和葡萄糖对菌株吲哚降解能力影响较大，分别下降了55.7%和47.2%。这说明在有柠檬酸钠和葡萄糖等碳源存在的情况下，菌株IDO5优先利用其它碳源，对吲哚的利用排在之后，从而影响了吲哚的降解。

图7 外加碳源对IDO5降解猪粪废水中吲哚的影响Fig. 7 Effect of exogenous carbon source on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

由于所选择的几种碳源物质对吲哚的降解均起到抑制作用，因此IDO5降解猪粪废水中吲哚最佳的条件为pH 9、温度37℃和转速170 r/min。后续实验将继续考察在此条件下IDO5对猪粪废水吲哚的降解情况。

2.4 反应时间对菌株IDO5降解吲哚的影响

在优化的条件下，本文比较了不同时间下菌株IDO5降解猪粪水中吲哚的影响。由图8可知，24 h内未加IDO5的猪粪废水中吲哚浓度几乎不变，维持在0.12 mg/L。但是加入菌株IDO5到猪粪水中后，从8 h开始吲哚的浓度即开始下降，猪粪水中的吲哚含量在24 h内几乎完全降解，降解率超过98.2%，说明IDO5对猪粪水中吲哚有很高的去除效果，具有较大的应用前景。

图8 菌株IDO5降解猪粪水中吲哚在24 h内的变化情况Fig. 8 Variation of indole degradation in pig manure water by strain IDO5 during 24 h

2.5 底物浓度对菌株IDO5降解吲哚的影响

为考察菌株IDO5对吲哚的最大降解能力，实验比较了在猪粪废水中额外添加100、200和400 mg/L吲哚情况下IDO5的降解能力。由图9可知，菌株IDO5对于不同浓度的吲哚均有一定的降解能力。但是随着底物浓度的增加，吲哚的降解率也不断减少，菌株IDO5在100 mg/L吲哚的条件下对吲哚的去除率最高，24 h内达到93.7%，对200 mg/L和400 mg/L吲哚降解率明显低于100 mg/L，分别达到70.5%和41.5%。

图9 菌株IDO5对不同浓度吲哚在24 h内的降解情况Fig.9 Variation of indole degradation in different concentrations by strain IDO5 during 24 h

2.6 菌株IDO5降解产物分析

对菌株IDO5降解吲哚的中间产物进行GC-MS分析，如表2所示，在菌株IDO5降解10 h和24 h后，反应体系中产生了很多中间产物，一些物质的含量随反应时间的延长，信号值不断增大。其中含苯环的物质包括 1，3-二叔丁基苯（benzene，1，3-bis）、α-羟基异丁酰苯（2-hydroxy-2-methylpropiophenone）和邻甲基苯甲醛（2-methylbenzaldehyde）。邻甲基苯甲醛与吲哚具有相同的苯环基团，而且和已发现的吲哚降解产物邻氨基苯甲酸结构高度相似，因此推测IDO5降解吲哚可能是通过邻氨基苯甲酸途径。除此之外，在吲哚降解过程中还发现了一些开环结构的物质出现，如4-甲基癸烷（4-Methyldecane）、1-壬醇（1-Nonanol）和2-十一烯（2-Undecene）等可能是吲哚的深度降解产物。

表2 菌株IDO5降解吲哚GC-MS目标组分谱Table 2 Target component spectrum of indole degrading GC-MS by strain IDO5

3 讨论

目前关于吲哚降解的微生物种类并不多见，而且不同的吲哚降解菌对吲哚的降解效率有较大差异，由表3可知Pseudomonas aeruginosaGs降解58.5-175 mg/L吲哚大约需要36 d，Comamonas sp. IDO1与Xenophilus sp. IDO4 降解100 mg/mL吲哚需要160 h，而Cupriavidus sp. SHE能够在24 h完全降解100 mg/mL吲哚。本实验中的海氏肠球菌（Enterococcus hirae）IDO5是一株新型的吲哚降解菌株，不仅能够直接应用于猪粪降解，而且能在24 h内降解100 mg/mL吲哚高达93.7%，和上述菌株相比，降解能力相当。但是菌株IDO5能够在更复杂、更极端的环境下保持稳定且高效的吲哚降解作用，且菌株IDO5具有底物广谱性，不仅能高效降解吲哚，对其他污染物的降解也能保持在较高的水平，说明菌株IDO5是一株性能良好且稳定的有毒污染物降解菌株。

表3 吲哚降解菌资源Table 3 Resources of indole degrading bacteria

根据前期对吲哚好氧降解菌的研究中发现，目前已知的研究较为透彻的吲哚降解途径主要有：吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸→水杨酸→邻苯二酚途径和吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸→龙胆酸途径［30］。许多研究证明靛红和邻氨基苯甲酸是微生物降解吲哚过程中的关键中间产物，也说明了细菌通过吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸可能是微生物降解吲哚普遍存在的机制。本研究在观察产物颜色的过程中发现，降解产物呈明显的红色，说明菌株IDO5也可能是通过吲哚→靛红途径降解吲哚。除此之外，对菌株IDO5降解吲哚进行产物GC-MS分析，检测到了邻甲基苯甲醛的出现。因此如图10所示，菌株IDO5可能是通过吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸→邻甲基苯甲醛途径降解吲哚。但是本文并没有检测出邻甲基苯甲醛进一步转化的产物，这可能和所选用的仪器条件不适合这些物质的检测有关。在后续的研究中将进一步深入分析降解产物结构，确定其降解途径。

图10 菌株IDO5降解吲哚途径推测Fig.10 Pathway of indole degradation by strain IDO5

4 结论

本研究发现一株高效吲哚降解菌IDO5，经鉴定为海氏肠球菌（Enterococcus hirae），其降解吲哚最佳条件为：温度37℃，转速170 r/min，pH 9，在此条件下能够在24 h内对猪粪废水中吲哚的降解效率高达98%，在猪粪废水中额外添加100 mg/L吲哚，去除效率仍然可达到93.7%。除吲哚外，菌株IDO5能够降解多种吲哚衍生物和有机污染物，展现出较宽泛的底物谱。利用GC-MS分析菌株IDO5降解吲哚的产物结构，得出吲哚可能是通过吲哚→靛红→邻氨基苯甲酸→邻甲基苯甲醛途径降解。综上，菌株IDO5在畜禽废水处理中具有一定的应用潜能。