杨树PR10基因应答杨树叶枯病与非生物胁迫表达1)

张弛 王宇婷 顾咏梅 贾丰璘 周博如

(东北林业大学，哈尔滨，150000)

病程相关蛋白(PRP或PRs)是植物应对外界非生物与生物胁迫环境，诱导产生的一类蛋白[1-2]。其中，植物对非生物胁迫的适应主要受ABA-依赖、ABA-非依赖2种信号转导途径调控。水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)在抵御生物胁迫中发挥重要功能，这些激素间往往形成1个具有协同、拮抗作用的交叉通路网络，最终诱导并激活一系列防御相关基因的表达[3]。PR蛋白主要分为17个家族,广泛存在于开花植物中, 是植物防卫系统的重要组成部分[4]。在病原体侵染、非生物胁迫及相关信号分子、过敏性坏死反应、系统获得性抗性进程中，PR蛋白会不断产生、积累，继而在植物抵御生物及非生物胁迫时发挥重要作用[4-5]。第一个PR10基因是1988年从欧芹中分离鉴定的，其重要特征是具有1个P环的富含甘氨酸保守结构域(GxGGxGxxK)，该结构域影响PR10蛋白的核酸酶活性。PR10蛋白另一特征是可形成1个Y型疏水腔，疏水腔参与脂肪酸、细胞分裂素、多类黄酮类化合物等非极性配体的胞内运输[5]。PR10蛋白疏水腔通过形态、结构变化与不同配体结合，在植物防御、生长发育进程中发挥作用[6-7]。葡萄PR10蛋白具有核酸酶活性[8]。PR10基因可通过染色体簇的形式进行多拷贝复制，从而调节植物的生长发育及适应不利环境[9]。RSOsPR10是一种新的水稻PR10蛋白，在盐和稻瘟病感染时，可通过茉莉酸信号通路被激活，迅速在根中表达[10]。杨树具有生长速度快、适应性强、分布范围广、材质优良等特点，是我国重要的绿化、造林、用材树种。在我国，土壤盐碱化及杨树相关病害严重影响了杨树的生存、生长发育，成为限制杨树生产和经济应用的因素[11]。通过研究杨树在高盐、生物胁迫及相关信号分子环境的表达特点，可为改良杨树抗逆能力、扩大杨树栽培范围，提高我国林业的生产潜力提供思路。

本研究为探明小黑杨PR10基因应答高盐、生物胁迫及相关信号分子环境下的表达特点，从小黑杨(Populussimonii×P.nigra)中克隆PR10基因cDNA片段，对PR10基因进行生物信息学分析，用RT-qPCR分析PR10基因在盐(NaCl)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸、杨树叶枯病病原菌胁迫条件时的表达特性，为探明PR10基因在杨树抗逆中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 目的基因的克隆和表达分析

将来自同一无性系的双单倍体小黑杨组培苗进行扩繁，将生长1个月的组培苗洗掉培养基，在相对湿度为 60%～70%、14 h光/10 h暗、平均温度25 ℃条件下继续水培1个月。将材料分为5组，每组分为0、12、24、48 h 4个时间点，每个时间点3个生物学重复。分别用水(对照组)、150 mmol·L-1NaCl、2.5 mmol·L-1水杨酸、150 mmol·L-1茉莉酸甲酯胁迫，并使用叶枯病菌饼进行接种[12-13]胁迫。处理0、12、24、48 h后，采集小黑杨的根、叶放入液氮速冻，于冰箱-80 ℃保存。

根据杨树基因组数据库信息、基因保守结构域设计引物(表1)，以Actin(基因登录号:JM986590)为内参引物进行试验。对目的基因进行PCR扩增、克隆，挑选阳性克隆送至上海生工生物工程公司测序。使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit提取小黑杨总RNA，通过Primer Script TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将其反转录成cDNA，每个处理包含3个生物重复。用无菌水将cDNA质量浓度稀释至(100±1)ng·μL-1，作为实时荧光定量PCR的模板。采用SYBR®Premix Ex TaqTMII荧光定量试剂盒并参照说明书配置反应体系(表2)进行试验。用美国 Thernofisher ABI-7500荧光PCR仪进行RT-PCR反应，反应程序为：阶段一——95 ℃、30 s；阶段二——95 ℃、 5 s，60 ℃、34 s，循环40次；阶段三—— 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。通过2- ΔΔCT公式计算目的基因在不同样品的相对表达量，采用SPSS 20软件进行数据处理，并采用邓肯氏新复极差法分析差异显著性。

表2 PR-PCR反应体系

1.2 生物信息学分析

分别用ExPasy(http://web.expasy.org/protparam)在线Protparam软件、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)的Kyte and Doolittle算法、Singa-P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)的神经网络算法、TMPred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html#opennewwindow)对PR10蛋白氨基酸的理化性质、PR10蛋白的亲水性、PR10蛋白的信号肽和跨膜结构进行预测分析。用SOMPA、swissmodel(http://swissmodel.expasy.org)预测PR10蛋白的二级结构、三级结构。利用NCBI数据库Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对PR10蛋白的氨基酸序列进行同源序列比对。使用MEGA-X(Version 10.0.5)软件选择Neighbor-joining模式并将设bootstrap replications设定为500次构建进化树，用在线预测软件Yloc(https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi)进行亚细胞定位预测分析[11]。

1.3 PBI121-GFP-PR10植物表达载体构建

根据载体PBI121-GFP与目的基因PR10基因序列，设计含Spe1单酶切位点的酶切引物(表1)，并进行PCR扩增和克隆。将PR10基因片段定向插入PBI21-GFP载体，构建GFP-PR10融合蛋白表达载体，选阳性克隆菌液送至上海生工生物工程公司测序。

表1 试验引物设计

1.4 基因枪瞬时转化

利用基因枪法对洋葱表皮细胞进行瞬时转化。将V(钨粉)∶V(0.1 mol·L-1亚精胺)∶V(2.5 mol·L-1氯化钙 )∶V(1 μg·uL-1质粒)=50∶20∶50∶5 混合，通过涡旋振荡、离心、悬浮等步骤，最后使用无水乙醇与微粒混匀，制备成微载体。参考PDS-1000台式基因枪使用说明，在气压值达 1 300 psi 时进行基因枪瞬时转化。瞬时转化后的洋葱表皮暗培养24 h后，在激光共聚焦显微镜下进行观察。

2 结果与分析

2.1 PR10基因克隆及氨基酸理化性质

从小黑杨cDNA中克隆获得的PR10基因片段，长度为477 bp，编码158个氨基酸，含20种氨基酸，具完整的开放阅读框。PR10蛋白的分子量为17.6 KDa，等电点为5.20，不稳定系数为34.32，属于稳定蛋白。PR10蛋白总平均疏水指数为-0.186，亲水性区域分布均匀，氨基酸数量较多，为亲水蛋白(图1)。在线软件SOPMA对杨树PR10蛋白氨基酸序列二级结构预测显示(图2)，该蛋白含有α-螺旋、β-折叠、延伸链无规则卷曲(表3)。在线软件swissmodel预测得到图3所示杨树PR10蛋白三维结构。

图3 PR10蛋白三级结构预测图

表3 PR10蛋白的二级结构

图1 PR10蛋白氨基酸亲疏水性区域分布图

序列位置

2.2 信号肽及跨膜结构域预测

信号肽是N端引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的一段氨基酸序列，通常由20～30个氨基酸残基组成。信号肽预测结果表明，PR10蛋白不存在信号肽(图4)。跨膜结构是一段一般由20个左右的疏水性氨基酸组成的片段，主要形成α-螺旋。根据在线工具TMPred预测PR10蛋白的跨膜结构，该基因蛋白不存在跨膜结构(图5)。

图4 小黑杨PR10蛋白信号肽预测

图5 小黑杨PR10蛋白跨膜结构预测和分析

2.3 同源性分析

将小黑杨PR10基因与其他同源蛋白基因序列进行比对，构建系统进化树(图6)。结果显示，小黑杨PR10与来自毛果杨(Populustrichocarpa)、毛白杨(Populustomentosa)的PRs蛋白亲缘关系较近，聚成一类。而与木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)、葡萄(Vitisvinifera)、欧洲水青冈(Fagussylvatica)、欧洲栓皮栎(Quercussuber)的PRs蛋白亲缘关系较远。

图6 系统进化树

2.4 亚细胞定位分析

构建GFP-PR10融合表达载体，用基因枪转化洋葱表皮细胞，用激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位(图7)。结果表明，对照GFP载体在整个洋葱表皮细胞中均有表达，而GFP-PR10融合蛋白表达载体只能在细胞核中看到绿色荧光。说明PR10定位于细胞核中，这与在线预测软件Yloc预测分析结果一致。

A、D为暗场观察；B、E为明场观察；C、F为二者结合效果。

2.5 PR10基因差异表达分析

在正常条件时，PR10基因在杨树叶片、根系中均有表达，在根系中的表达水平明显高于在叶片中的表达水平(表4)。PR10基因受胁迫诱导表达，叶枯病病原菌、NaCl、水杨酸、茉莉酸甲酯均能引起PR10基因上调表达。在叶枯病病原菌胁迫时，PR10基因在叶中的表达水平明显升高，在48 h的表达水平约为非胁迫对照表达水平的8.86倍。PR10基因在根中表达水平随胁迫时间延长，表达水平有下降的趋势，但和对照相比未达到显著差异水平。受到盐胁迫时，PR10基因在叶片、根中的表达水平显著提高，呈现出先升高后降低的趋势。盐胁迫下PR10基因在根中12 h时表达水平达到最大，约为非胁迫对照表达水平的15.25倍；在叶中表达水平于12 h时达到峰值，约为非胁迫对照表达水平的2.64倍。水杨酸、茉莉酸甲酯胁迫时，PR10基因在根、叶中的表达水平及变化趋势与其在盐胁迫时的表达趋势相似，水杨酸胁迫使根中PR10基因在24 h时达到最大值，表达水平提高3.75倍；茉莉酸甲酯胁迫使根中PR10基因在12 h时达到最大值，相对表达量提高8.29倍。上述结果说明，PR10基因表达具有组织特异性，并受胁迫诱导表达。

表4 PR10基因相对表达量

3 讨论

病程相关蛋白是植物在受到外源病原体入侵时，体内会通过一系列应激反应诱导表达的一类蛋白[14]。PR蛋白在植物的生长发育和应对生物、非生物胁迫时起到非常重要的作用。PR蛋白分为17个家族，PR10蛋白是其中具有核酸酶或者合成酶活性的1个家族。PR10蛋白能在病毒、细菌、真菌等生物胁迫条件和非生物胁迫时被诱导表达。当胁迫信号被植物细胞表面受体感知，受体会被激活进而引发信号初级跨膜转导，胞内产生Ca2+、ROS、cAMP等第二信使，并将信号级联放大，通过JA/SA、ABA-依赖、ABA-非依赖的信号通路激活WRKY、bZ1P、DREB、MYB等诸多转录因子，特异性识别启动子上的ACCTGACC序列、WRKY、W-box、DRE元件等保守结构域并相结合起到调控PR10基因表达的效果[15]。

PR10基因能在生物胁迫下诱导并参与防御反应。据报道，PR10蛋白在甘蔗黑穗病(Sporisoriumscitamineum)胁迫时能提高叶片细胞中H2O2的积累水平，并增强其对青枯病菌、绿脓杆菌侵染的抗性[16]。在被真菌炭疽病菌侵染时，PR10蛋白积累在白羽扇豆(Lupinusalbus)植株的叶片中[17]。在水稻中，稻瘟病菌感染叶片的试验表明，RPR10a在对病菌的反应中以局部方式表达最强烈[18]。本研究中，杨树在接种杨叶枯病后，叶片中PR10基因表达量在48 h内迅速增加并积累，参与植物的防御反应。

PR10基因表达除受病原微生物诱导之外，还受非生物胁迫，如伤害、寒冷、干旱、高盐、氧化、金属离子、紫外辐射等的诱导。白羽扇豆PR10蛋白在根系发育的所有阶段均有组成性表达，在其他植物部位也有较小程度的表达，且存在RNAse活性[19]。此外，羽扇豆中PR10基因会受紫外辐射诱导[17]。在西部白松受伤害诱导后，PR10在基因及蛋白水平上均快速升高[20-21]。寒冬里，兰伯氏松及西部白桦的根中PR10蛋白水平积累到最高水平[22]。同样，冷胁迫诱导PR10的表达也发生在桃树中，冬季大量积累在树皮、木质部中的蛋白质，被认为是储存氮的载体，有助于树木抵御或恢复非生物及生物胁迫[23]。本研究显示，盐胁迫能诱导根部的PR10基因迅速且大量地表达，说明杨树PR10基因参与到了盐胁迫的抗逆进程中。杨树PR10基因还能被茉莉酸甲酯、水杨酸诱导，但其对水杨酸的反应相较于茉莉酸甲酯，表现更慢，2种激素诱导的PR10基因表达量均随着时间增加而降低，这一点与在JcPR10及RSOsPR10中的研究一致[13，24]。不过，在JcPR10a研究中水杨酸与茉莉酸互为抑制反应，这一点在本研究中未能展现[13]。

本研究中，从小黑杨中克隆出477 bp的PR10基因，对该基因进行了生物信息学分析、不同植物同源蛋白进化树构建、亚细胞定位、时空表达分析。PR10基因在应答高盐、茉莉酸甲酯、水杨酸、杨树叶枯病胁迫时具有明显的组织特异性，且具有较高的表达。说明杨树PR10基因参与植物渗透胁迫，与增强植物抗逆性有关，可以作为杨树抗逆分子育种的备选方向。