应用高效液相色谱技术建立检测巴西橡胶树叶片和枝条中4种植物激素的方法1)

陈华峰 郭冰冰 代龙军 杨洪 赵溪竹 王立丰

(东北林业大学，哈尔滨，150040)(中国热带农业科学院橡胶研究所)

植物激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸在林木生长发育和抗逆生理中具有重要作用[1]。国际上认定的主要激素，为生长素类(IAA)、赤霉素类(GAs)、细胞分裂素类(CKs)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、油菜素内酯类(BRs)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、独脚金内酯类(SLs)，分别在促进植物生长、催芽[2]、促进茎的伸长、开花[3]、果实膨大[4]、抗逆、早熟、抗病、抗虫等过程起到关键作用；植物激素还存在剂量效应和交互作用[5-6]；因此植物外源和内源激素含量的分析与检测，在理论研究和实际生产中具有重要地位。近年来植物激素检测方法进展迅速，前处理技术主要采用固相萃取(SPE)小柱；检测方法主要采用酶联免疫法、气相色谱、液相色谱、气质联用、液质联用、毛细管电泳、液相色谱-串联质谱联用等[7]。检测数量从单一激素检测[8]多达39种激素同时检测[9]。为植物生理、食品科学和遗传育种等学科的发展提供了精准的定量化技术。

天然橡胶产业，长期以收集胶乳作为工业原料为主，以木材、种子等其他生物量开发利用为辅[10]。橡胶树多以芽接苗[11]、组培苗[12]等作为种植材料，种植后6～8 a，树干周长超过50 cm后，割取树皮，取韧皮部乳管细胞的胶乳[13]。在橡胶树中已经证明，激素对橡胶生物合成[14]、芽接苗砧穗结合[15]、橡胶树乳管分化[16]、愈伤组织诱导[17]等均具有重要作用；已经相继研究出树皮茉莉酸含量[18]、茉莉酸自显影[19]、气相色谱检测乙烯[20-21]、胶乳中4种植物激素(生长素、玉米素、赤霉素、脱落酸)的检测方法[22]。随着分子生物学在天然橡胶研究中不断拓展和从产量目标向质量目标的转变[23]，植物激素在橡胶树叶片和枝条等部位的功能持续得到挖掘和拓展[24-25]。建立橡胶树叶片和枝条等部位的简便、快捷的激素检测方法，对橡胶树基础理论研究和技术研发具有重要意义。为此，本研究在借鉴已有研究成果基础上，以2002年定植于中国热带农业科学院试验场三队的巴西橡胶树(HeveabrasiliensisMuell. Arg.)热研73397的枝条和叶片为研究对象，采用安捷伦1260II高效液相色谱仪测定叶片和枝条中的生长素、玉米素、赤霉素、脱落酸，分析高效液相色谱技术在植物激素检测中的应用，优化植物激素提取方法，建立了一种同时检测巴西橡胶树叶片和枝条中4种植物激素的检测方法。旨在为精确定量研究橡胶树排胶前后过程中激素信号的功能提供参考。

1 材料与方法

试验树种：巴西橡胶树，品种为热研73397；2002年定植于中国热带农业科学院试验场三队，2010年开割。用枝剪取树干上部枝条和叶片，置于液氮中密封保存备用。

主要仪器：安捷伦1260II高效液相色谱仪(美国安捷伦技术有限公司生产)、RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产)。

主要试剂：植物激素标样玉米素(ZT，Z0876)、生长素(IAA，H8876)、赤霉素(GA3，48880)、脱落酸(ABA，A1049)、抗氧化剂二丁基羟基甲苯(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，BHT，B1378)，均购自Sigma公司。色谱纯甲醇、乙腈购自德国MERCK公司。其他试剂均为分析纯，购自生工生物工程公司。试验用水为超纯水，经0.45 μm有机过滤器过滤；过滤柱为ProElut PXC 60mg/3mL 300/pkgPXC小柱，购自中国迪马科技公司。

样品提取和前处理方法：样品的前处理方法，将采集的叶片、枝条样品，用液氮密封保存，在避光条件下带回实验室。取叶片、枝条各0.5 g，在液氮中碾磨后，加入5 mL体积分数为80%色谱纯的甲醇和质量浓度为1 mg/L的抗氧化剂二丁基羟基甲苯，避光条件下4 ℃提取24 h。提取液在15 000 r·min-1、4 ℃条件，离心10 min。取出上清液，残渣加入5 mL体积分数为80%色谱纯的甲醇和质量浓度为1 mg/L的抗氧化剂二丁基羟基甲苯，避光条件下4 ℃再次提取24 h、再次离心。合并2次上清液，滤纸过滤，加50 μL氨水，在40 ℃下用旋转蒸发仪减压蒸发至水相。水相用浓度为0.1 mol·L-1的稀盐酸调pH至3.0，样品过固相萃取小柱。固相萃取小柱使用方法：首先采用10 mL甲醇活化，随后用10 mL超纯水平衡；将处理好的样品注入固相萃取小柱，分别用10 mL浓度为0.1 mol·L-1的HCl、10 mL甲醇洗脱。洗脱液在40 ℃下减压蒸发至近绝干，用1 mL的色谱纯甲醇溶解、0.22 μm有机相针式滤器过滤、-80 ℃保存，用液相色谱仪检测。

4种植物激素色谱检测方法：色谱柱为美国Waters公司生产的CNWSIL C18液相色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。柱温30 ℃；流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)为15∶15∶70、pH为3.5的等度洗脱；流速为1 mL·min-1；进样量为10 μL；检测波长为254 nm。以标样出峰时间和峰高叠加定性，用外标法对峰面积定量。

4种植物激素标准液和混合标准液的配制：分别称取4种植物激素(玉米素、生长素、赤霉素、脱落酸，精确至0.001 mg)，用色谱纯甲醇溶解，至终质量浓度为0.1 mg·L-1，转移到1.5 mL离心管中避光保存，置于冰箱中设置4 ℃保存备用。混合标准液的配制时，准确吸取各组分适量的标准液混合，用色谱甲醇定容，转移到棕色试剂瓶中，置于冰箱中设置4 ℃保存备用。

4种植物激素标准曲线设计和检出限确定：配置曲线质量浓度为0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、2.000、10.000 mg·L-1的标准质量浓度系列，经液相色谱仪检测后，以标准系列对应的峰面积为纵坐标，标准系列质量浓度为横坐标，建立坐标系进行线性分析，得到4种激素的标准曲线方程。由3倍基线噪音得到的检测量作为检出限(Lod)，10倍基线噪音得到的检测量作为定量下限(Loq)。将上述估计的Loq值作为样品的添加质量浓度，做7次重复，计算出其标准偏差。Lod、Loq计算公式为：Lod=t×S、Loq=3×Lod。式中：t是自由度为n-1、置信度为99%时的t值(本试验7次重复，n=7，自由度为6，参考t值表，取t值为3.143)；S为n次平行测定的标准偏差。

4种植物激素的检测回收率计算方法：取橡胶树叶片，经粉碎均匀后称量成0.1 g的小份，分别加入10 μg激素标准样品，静置30 min，按“样品提取和前处理方法”提取后，进行回收试验。每个添加水平重复3个样本，每个样本重复测定6次，计算平均回收率。

2 结果与分析

2.1 4种植物激素混合样品的色谱检测结果

将激素质量浓度分别为0.1 mg·L-1的玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸标准品混合后，按照此色谱检测方法进行检测，分析效果。结果表明，该方法可一次性将4种植物激素在15 min内全部检测出来(见图1)。由图1可见：4种激素洗脱的先后顺序为玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸，洗脱时间分别在2.166、3.871、8.133、13.405 min，峰面积分别为3 549、70 609、751 048、3016，峰面积占比分别为0.43%、8.53%、90.68%、0.36%，峰高分别为733、1 686、33 438、107。4种激素区分效果明显，检测时间短。

图1 4种植物激素混合标准品色谱图

2.2 4种植物激素混标样的色谱检测曲线和检出限

在检测方法成功的基础上，为了建立回归方程和检出限，进一步将质量浓度为0.001、0.010、0.100、0.500、1.000、2.000、10.000 mg·L-1的4种激素标准样品进行高效色谱检测，根据检测结果建立回归方程、计算检出限(见表1)。

表1 4种植物激素高效液相色谱检测回归方程和最低检出限

2.3 巴西橡胶树叶片和枝条中4种激素质量分数测定

在建立标准曲线的基础上，取0.5 g健康橡胶树绿熟期叶片、枝条进行4种植物激素质量分数测定。结果表明，所有样品均可在2.195、3.838、8.053、13.893 min鉴定出4种植物激素的特异峰(见图2)。按照回归方程计算得出，正常橡胶树绿熟期叶片玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸质量分数(以鲜叶质量计算)分别为151.17、190.77、0.19、37.10 μg·g-1；正常的枝条玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸质量分数(以鲜枝条质量计算)分别为1 581.64、5.07、0.12、65.85 μg·g-1。叶片中赤霉素质量分数最高，枝条中玉米素、脱落酸质量分数相对较高。

图2 巴西橡胶树叶片中4种植物激素色谱图

2.4 4种植物激素的加标回收率

将热研73397叶片经粉碎均匀后称量0.1 g，分别加入10 μg激素标准样品，静置30 min，待其充分混入样品后，进行激素提取和测定分析。经计算，采用本方法测定的4种激素玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸，加标回收率分别为85.63%、106.31%、90.91%、109.13%(见表2)，符合标准，进一步证明了本方法的可靠性。

表2 巴西橡胶树叶片4种激素加标回收率

3 结论与讨论

由于植物激素具有痕量且又重要的特点，其测定中最大难度是植物激素检测不灵敏，或是内源激素浓度变化范围大[26]。因此，人们不断创新激素检测方法，如早期的同位素示踪分析乙烯[27]，用放射免疫检定法测定玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸等[28]，到最新的气相、液相色谱-串联质谱联用等[29-30]。样品提取总的要求是尽可能完全地提取出所含植物激素成份，尽量少提取出干扰物质。在选择提取溶剂时，选择和待测植物生长调节剂极性相近的溶剂，并且提取剂不能与样品发生反应，毒性较低[29]。对非极性的植物生长调节剂，可以用非极性溶剂提取，也可用混合溶剂提取；对含水量较高的样品，如蔬菜[31]、水果[32]等，宜用极性溶剂，常用的提取剂有甲醇、丙酮、乙醇、乙腈等。由于林木中激素含量变化幅度较大，如采用用放射免疫检定法测定土耳其栎等14种林木的玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸，结果发现，4种激素浓度变化分别在7.1～50.4 nmol·L-1、0.9～22.7 mg·L-1、40～750 nmol·L-1、30～920 nmol·L-1[28]，因此，人们常在前处理优化和检测程序上优化提取和检测方法。在提取时，通常加入正己烷、乙酸乙酯、盐酸增加提取效率[33]。龚明霞等[34]根据玉米素分子中嘌呤环侧链末端带1个极性羟基、生长素分子中碳链末端带有1个极性羧基、赤霉素分子中弱极性的碳环被极性的基团(羟基、羧基、酯基)包围而使得整个分子具有中等极性、脱落酸带有极性的羟基和羧基，设计梯度洗脱检测植物中激素。易勇等[35]分析海藻玉米素、吲哚丁酸、吲哚乙酸、脱落酸这4种激素，在前处理部分采用体积分数为70%的甲醇提取，加了抗氧化剂二丁基羟基甲苯防止氧化，同时分别采用混合型弱阳离子交换和混合阴离子交换柱两种固相小柱净化，回收率达90%以上。本研究中，采用体积分数为80%色谱纯的甲醇提取，只用固相萃取小柱一次净化，加标回收率在85.63%～109.13%(见表2)，这与已有研究结果相一致。

适合的甲醇浓度既可以提高生长素的提取效率，又可以保证4种植物激素能够有效分开。刘婷等[36]建立了根际促生菌玉米素、生长素、脱落酸的检测方法，发现仅以甲醇-水为流动相，其色谱图峰形畸变、不对称，且拖尾严重，加入一定的乙酸抑制溶质的离子化，使分离得到改善。本研究中，进一步采用V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)为15∶15∶70、pH为3.5的等度洗脱，4种激素在15 min内即可得到完全分离。王杏等[32]在20 min之内检测出果树中玉米素、生长素、脱落酸等6种植物激素，本研究结果的洗脱时间与文献[32]的相近；在方法的检出限方面，本研究结果的检出限(0.5～3.1 μg·L-1)与文献[32]的检出限(1.4～30 μg·L-1)近似。李华等[37]建立了枇杷果实中10种激素的检测方法，加标回收率在58.6%～85.2%，这既与果实中成分复杂、干扰率高有关，也与激素检测次数过多有关，可见一次性检测4种激素的准确度更高。

针对橡胶树已经分别建立了胶乳中4种激素的检测方法，其中：玉米素采用等度洗脱方法，赤霉素、生长素、脱落酸采用梯度洗脱方法，这些方法存在无法一次性检测4种激素的缺点，且回收率在70%～92%之间。

本研究采用液氮研磨处理巴西橡胶树叶片和枝条，体积分数为80%色谱纯的甲醇暗中抽提24 h，离心后减压蒸发后过固相萃取小柱淋洗，用盐酸和色谱纯的甲醇洗脱后，1 mL甲醇溶解提取物。样品测定采用安捷伦1260II高效液相色谱仪，反相色谱柱CNWSIL C18 4.6 mm×150 mm 5 μm，柱温30 ℃；流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(磷酸)为15∶15∶70、pH为3.5的等度洗脱。检测限低至0.5 μg·L-1，加标回收率在85.63%～105.13%。本研究检测方法，建立了橡胶树叶片和枝条的简便、快捷的激素检测方法，可为精确定量研究橡胶树排胶前后过程中激素信号的功能提供参考。