不同浓度盐胁迫对桑树光合系统的影响1)

张倍宁 高世醒 车延辉 孙广玉

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

盐碱地是指土壤里面含有的盐分影响到作物正常生长的土地，当前根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地面积为9.543 8亿hm2，其中我国约为9 913万hm2[1]。在严重的盐碱土壤地区许多植物几乎不能生存，宝贵的土地资源被浪费，使得生态经济与产业发展都面临着巨大挑战与威胁。深入研究植物耐盐机制，高效利用盐碱地，使盐碱地对于我国经济持续健康发展、国土治理、生态环境保护等具有极其重要的现实意义。

有研究表明，盐胁迫会诱发植物体内多种结构和功能的改变，抑制植物的光合作用[2]，且盐浓度越高、时间越长，抑制作用越明显[3-5]。迄今为止，有许多学者报道了对于不同植物通过光合作用调节植物盐代谢的机理，研究发现，盐胁迫可以抑制高粱幼苗光合系统Ⅱ(PSⅡ)原初光能转换效率和 光合系统Ⅱ潜在活性，增加光合系统Ⅱ非辐射能量的耗散[6]。而麻疯树幼苗会通过增强类囊体膜等细胞膜的稳定和膜功能等，从而促进细胞光合等生理生化代谢[7]。桑树作为重要耐盐植物，已有研究发现，盐胁迫时Na+的积累会减少对K+、Ca2+、Mg2+的吸收，抑制这些离子的生理功能；桑树在长期盐胁迫时，还会导致水势下降，而形成水分胁迫，限制了水分进入细胞[8]；外界CO2浓度的变化，也会影响桑树幼苗的净光合速率[9]。环式电子传递在植物逆境胁迫中发挥重要的作用，有研究表明，环式电子传递在提高桑树的抗旱性方面发挥重要作用[10]。但目前关于不同盐浓度对桑树叶片光系统的损伤位点、环式电子流对不同盐浓度时桑树光合系统Ⅱ的保护机制，还没有得到共识。

本研究以黑龙江省蚕业研究所提供的1年生‘秋雨桑’(MorusalbaL.)实生苗为试验材料，在东北林业大学植物生理实验室分别用浓度为100、150、200 mmol/L的盐溶液处理桑树枝条，以蒸馏水作为对照处理；应用脉冲调制荧光仪(FMS-2)和多功能植物效率分析仪(M-PEA)联合的方法，测定叶片还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶复合物依赖型的环式电子传递、质子梯度调节(PGR5)依赖型的环式电子传递、快速叶绿素荧光动力学曲线、叶绿素荧光和光合系统Ⅱ反应中心吸收光能分配参数；采用单因素方差分析、最小显著差异法比较不同数据组间的差异，分析不同浓度盐胁迫处理对桑树叶片光系统的损伤位点。旨在为桑树光系统抵御盐胁迫及盐胁迫地区其他树种的栽植提供参考。

1 材料与方法

以黑龙江省蚕业研究所提供的1年生‘秋雨桑’实生苗为试验材料，于2020年2—12月份在东北林业大学植物生理实验室进行试验。将幼苗移栽到高17 cm、直径15 cm的由土与蛭石(V(草炭土)∶V(蛭石)=2∶1)混合均匀的盆钵中，待植株长到40 cm时，挑选长势一致的桑树，选取统一位置剪下枝条，进行预处理。

分别用浓度为100、150、200 mmol/L的盐溶液处理桑树枝条，以蒸馏水作为对照处理(CK)；将其放进光照培养箱中，黑暗14 h、光照8 h，观察枝条状态，并测定有关指标。每个处理都进行5个平行试验，处理桑树枝条4 d后测定各项指标。

叶片还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶复合物介导的环式电子流的测定：FMS-2脉冲调制荧光仪(Hansatech，英国)测量叶绿素荧光信号[11]，本研究将叶片暗适应处理30 min后，用作用光(54 μmol·m-2·s-1)诱导照射叶片300 s后关闭作用光；由于依赖NDH的环式电子流(CEF)的存在，关闭作用光后叶绿素荧光升高，用最低点和最高点的落差定性表示依赖NDH的环式电子流的大小。

叶片质子梯度调节(PGR5)介导的环式电子流的测定：利用多功能植物效率分析仪(M-PEA，Hansatech，英国)测定光合系统Ⅰ反应中心色素分子(P700)氧化还原动力学[10]，本研究将叶片30 min暗适应后，给予60 s 20%的弱远红光，再关闭弱远红光60 s，目的是使P700氧化后再在暗中被还原。之后，利用有效补充光(5 mmol·m-2·s-1)得到P700的回升最大值。给予弱远红光时P700会大幅降低，之后关闭远红光，因为环式电子流的存在P700会有所回升，用之间的落差表示PGR5介导的环式电子流。

叶片快速叶绿素荧光动力学曲线的测定：使用多功能植物效率分析仪(M-PEA)测定叶片暗适应30 min后的叶绿素荧光动力学曲线和820 nm光学反射曲线(MR820)[12]。本研究将在测定快速叶绿素荧光诱导动力学(OJIP)曲线时，诱导光强为3 500 μmol·m-2·s-1的红光脉冲。曲线上O、J、I、P点分别对应的时间为0.02、2.00、30.00、1 000.00 ms，将OJIP曲线标准化后，根据公式(Ft-Fo)/(Fm-Fo)分析各点的相对荧光强度，式中：Ft为各时间点的相对荧光强度，Fo为初始荧光强度，Fm为最大荧光强度。将O-K、O-J、O-P曲线标准化，即可分别得到相对可变荧光VO-K、VO-J、VO-P的时间对应曲线，便可分别分析J点(2.00 ms)、I点(30.00 ms)的相对可变荧光VJ、VI变化。光合系统Ⅰ(PSⅠ)反应中心用820 nm处最大吸光度(Im)与最小吸光度(Io)之差的相对值表示，ΔI/Io=(Im-Io)/Im。

叶片叶绿素荧光和光系统Ⅱ反应中心吸收光能分配参数的测定[13]：叶片30 min暗适应后，使用FMS-2脉冲调制荧光仪，测定初始荧光强度(Fo)、最大荧光强度(Fm)、光系统Ⅱ最大光化学效率(FV/Fm，FV为可变荧光强度)、光化学淬灭系数(Qp)、非光化学淬灭系数(QNP)、电子传递速率(RET)，过剩光能用(1-Qp)/QNP计算。

数据处理：运用 Excel(2016)、SPSS(23.0)软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析、最小显著差异法比较不同数据组间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度盐胁迫对桑树叶片环式电子流的影响

对桑树叶片分别进行不同浓度(100、150、200 mmol/L)的盐胁迫处理后，测得PGR5依赖型环式电子流的相关数据(见图1A、表1)，定量化处理后分析得出，不同处理的桑树叶片PGR5依赖型环式电子流都高于CK，其中浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理最为显著。浓度为100、150、200 mmol/L的NaCl胁迫处理的叶片，PGR5依赖型环式电子流分别比CK高4.07%(P>0.05)、24.39%(P<0.05)、6.07%(P>0.05)。浓度为150 mmol/L的NaCl胁迫处理的叶片，PGR5依赖型环式电子流分别比浓度为100、200 mmol/L的NaCl胁迫处理的叶片高16.34%(P<0.05)、14.73%(P<0.05)。

表1 不同浓度盐胁迫时叶片的PGR5依赖型环式电子流

关闭作用光后，由于NDH依赖型环式电子流的存在，荧光曲线会上升(见图1B)，4种处理时的NDH介导的环式电子流都显著升高，浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的NDH依赖型环式电子流曲线均低于CK处理的。CK处理时的曲线在显著升高后开始缓慢下降，而不同浓度盐胁迫时的环式电子流曲线均继续缓慢升高。其中，浓度为100、150 mmol/L盐胁迫处理时的环式电子流曲线，分别在关闭作用光450、550 ms后开始超过CK的环式电子流曲线；而浓度为200 mmol/L的NaCl胁迫处理的NDH依赖型环式电子流一直处于较低状态。

图1 不同浓度盐胁迫时叶片的PGR5和NDH依赖型环式电子流

2.2 不同浓度盐胁迫对桑树叶片光合系统Ⅰ活性的影响

由图2可见：在远红光照明过程中，820 nm光信号的相对下降反映了光合系统Ⅰ的活性(ΔI/Io)。与对照相比，不同浓度盐胁迫处理的叶片ΔI/Io都呈下降趋势，并且随着盐浓度的增高，ΔI/Io逐渐降低(见表2)。浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理时的ΔI/Io，分别比CK低10.22%(P>0.05)、18.68%(P<0.05)、29.80%(P<0.05)；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理时ΔI/Io，分别比浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理时高9.42%(P>0.05)、21.81%(P<0.05)；浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理时的ΔI/Io，比浓度为200 mmol/L的盐胁迫处理时的高13.67%(P<0.05)。

图2 不同浓度盐胁迫时叶片的MR820曲线

表2 不同浓度盐胁迫时叶片的ΔI/Io

2.3 不同浓度盐胁迫对桑树叶片叶绿素荧光参数的影响

由图3A可见，VO-K曲线在不同浓度盐处理时没有显著差异，将VO-K曲线标准化处理后得到ΔVO-K曲线(见图3B)。与CK相比，不同浓度盐胁迫处理的叶片ΔVO-K曲线呈先上升后下降的趋势，其中浓度为150、200 mmol/L的盐处理，ΔVO-K曲线在0.15 ms左右达到最大值；将VO-J曲线(见图3C)标准化处理后得到ΔVO-J曲线(见图3D)，浓度为150、200 mmol/L的盐处理，ΔVO-J曲线随时间的增加，先显著上升，在0.3 ms左右达到峰值后下降。浓度为100 mmol/L的盐处理，ΔVO-J曲线由开始便迅速下降到最低点，然后再缓慢上升，但数值一直为小于零。

图3 不同浓度盐胁迫处理的叶片叶绿素荧光参数

在OJIP曲线上通过标准化点J获得相对荧光强度(见表3)，在不同的盐浓度胁迫时相对荧光强度(VJ)均高于CK处理，浓度为100、150、200 mmol/L的盐处理的VJ，分别比CK高7.07%(P>0.05)、35.00%(P<0.05)、12.25%(P>0.05)；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理的VJ，分别比浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理的低26.09%(P<0.05)、4.84%(P<0.05)。在OJIP曲线上通过标准化点I获得相对荧光强度(见表3)，不同盐浓度胁迫时的相对荧光强度(VI)均高于CK处理，浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的VI，分别比CK高4.91%(P>0.05)、9.06%(P<0.05)、1.95%(P>0.05)。

表3 不同浓度盐胁迫时叶片的VJ、VI

2.4 不同浓度盐胁迫对桑树叶片光合系统Ⅱ电子传递链和活性的影响

与对照相比，不同盐胁迫处理时，叶片的电子传递速率(RET)有一定降低(见表4)；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理时叶片的电子传递速率降低不显著，浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理时叶片的电子传递速率较CK的显著降低。浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片的电子传递速率，分别比CK低3.87%(P>0.05)、45.42%(P<0.05)、32.28%(P<0.05)。

与叶片的电子传递速率相似，不同盐胁迫处理时，叶片光合系统Ⅱ实际光化学效率(YⅡ)也都有一定降低(见表4)。浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理的叶片PSII实际光化学效率显著降低；浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光合系统Ⅱ实际光化学效率，分别比CK低27.80%(P<0.05)、19.34%(P>0.05)；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光合系统Ⅱ实际光化学效率，与CK差异不显著。

表4 不同浓度盐胁迫时叶片的电子传递速率(RET)和光合系统Ⅱ实际光化学效率(YⅡ)

2.5 不同浓度盐胁迫对桑树叶片热耗散及过剩光能的影响

由表5可见：浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光化学淬灭系数(Qp)，与对照相比有所增加；浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光化学淬灭系数，与CK相比较低；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光化学淬灭系数比浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光化学淬灭系数，分别高24.43%(P>0.05)、23.94%(P<0.05)。与对照相比，浓度为200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片非光化学淬灭系数(QNP)显著下降；浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理的叶片非光化学淬灭系数，比CK高3.76%(P>0.05)，比浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理的分别高25.83%(P<0.05)、34.32%(P<0.05)。随着盐浓度的逐渐增加，叶片过剩光能也逐渐增高；浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片的过剩光能，分别比CK高13.18%(P>0.05)、83.13%(P<0.05)、131.76%(P<0.05)。

表5 不同浓度盐胁迫时叶片的光化学淬灭系数、非光化学淬灭系数及过剩光能

2.6 不同浓度盐胁迫对桑树叶片最大光化学效率及光合性能指数的影响

由表6可见：不同浓度盐胁迫处理时的叶片光合性能指数(IP,abs)，均比对照处理显著降低。浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光合性能指数，分别比CK低48.61%(P<0.05)、69.36%(P<0.05)、51.30%(P<0.05)；浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理的叶片光合性能指数，分别比浓度为100、200 mmol/L的盐胁迫处理的低67.76%(P<0.05)、58.98%(P>0.05)。与对照组相比，浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理的叶片的总光合性能指数(IP,t)显著下降，较CK低40.36%(P<0.05)；浓度为100、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片总光合性能指数，较CK差异不显著。在叶片暗适应30 min后测得最大光化学效率，不同盐胁迫处理的叶片最大光化学效率都比对照有所降低；浓度为100、150、200 mmol/L的盐胁迫处理的叶片最大光化学效率，分别比CK低4.54%(P>0.05)、6.91%(P>0.05)、10.36%(P<0.05)。

表6 不同浓度盐胁迫时桑树叶片最大光化学效率、光化学性能指数及总光合性能指数

3 讨论

有研究表明，PGR5依赖的环式电子流可以保护光合系统Ⅱ反应中心，减少对光色素的应力损伤[14]。本研究中，桑树叶片经过不同浓度盐胁迫处理后，PGR5依赖型环式电子流都高于CK，其中浓度为150 mmol/L的盐胁迫处理最为显著(见图1A、表1)， 说明盐胁迫提高了PGR5介导的环式电子流的传递速率和传递能力，从而提高保护光合系统Ⅱ反应中心的能力，利于减少光色素的应力损伤，浓度为150 mmol/L的盐胁迫时传递效率最高。叶片暗适应处理30 min后，用作用光(54 μmol·m-2·s-1)诱导照射叶片300 s后关闭作用光，由于存在NDH依赖型环式电子流，导致关闭作用光后叶绿素荧光瞬间上升，所以可以通过观察叶绿素荧光瞬间上升是否缺失，判定NDH依赖型环式电子流的活性[15]。不同浓度盐胁迫处理的叶片NDH依赖型环式电子流，与CK相比显著降低(图1B)，说明盐胁迫抑制了NDH复合体介导的环式电子流的传递。

820 nm光学反射曲线(MR820)在不同处理时的数据用ΔI/Io表示，ΔI/Io反应了光合系统Ⅰ反应中心的活性[12]，其中浓度为200 mmol/L的盐胁迫时与CK相比显著降低(见图2、表2)，说明盐浓度越高对光合系统Ⅰ反应中心损害越大，进而影响了光合作用。

叶片的电子传递速率代表了线性电子传递速率，可以用来衡量光合电子传递能力[20]。光合系统Ⅱ实际光化学效率代表光合系统Ⅱ的光化学产量[21]。与对照相比，不同盐胁迫处理时，叶片的电子传递速率(RET)有一定降低。其中浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理时降低不显著，浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理时叶片的电子传递速率降低较显著(见表4)。说明盐胁迫降低了表观光合电子传递速率。盐胁迫对光系统Ⅱ实际光化学效率也有一定的影响，其中中度盐胁迫处理时的光系统Ⅱ实际光化学效率降低最为显著(见表4)，这正是因为中度盐胁迫阻碍了光合系统Ⅱ的QA到QB的电子传递所致。

光化学淬灭系数(Qp)代表光适应下光合系统Ⅱ进行光化学反应的能力，即开放的光合系统Ⅱ反应中心的程度[22]。浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理时的光化学淬灭系数与CK 处理相比显著增加，浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理时的光化学淬灭系数与CK相比有所降低(见表5)。说明一定的盐胁迫可以增加光合系统Ⅱ反应中心的开放程度，但是盐浓度过大反而会抑制光合系统Ⅱ反应中心的开放。非光化学淬灭系数代表非光化学淬灭，通过非光化学淬灭系数的调节使得光化学淬灭系数保持恒定，确保电子传递速率与CO2固定速率一致[23]。浓度为100 mmol/L的盐胁迫处理时的非光化学淬灭系数与CK 处理相比稍有增加，浓度为150、200 mmol/L的盐胁迫处理时的非光化学淬灭系数与CK相比有所降低(见表5)；说明一定的盐胁迫可以增加非光化学淬灭系数的调节能力，促进光化学淬灭系数保持恒定，耗散由于盐胁迫导致的过剩光能；但是，盐浓度过大，反而会扰乱非光化学淬灭系数的调节能力，使得光化学淬灭系数无法保持恒定。有研究表明，随着盐浓度的升高，过剩光能增加[24]。本研究表明，轻度盐胁迫处理，光合系统Ⅱ的过剩光能与CK没有差异(见表5)；结合非光化学淬灭系数指标说明，轻度盐胁迫的叶片可以通过调节非光化学淬灭系数耗散多余的热量，从而保护光系统。中度盐胁迫的过剩光能明显增加(见表5)，非光化学淬灭系数却降低(见表5)，但是PGR5环式电子传递增强(见表1)，说明中度盐胁迫处理激发了PGR5依赖型环式电子传递，将能量用于电子传递，而不是热耗散。重度盐胁迫，过剩光能增多(见表5)、非光化学淬灭系数降低(见表5)、NDH依赖型环式电子传递和PGR5依赖型环式电子传递均没有显著增加(见图1)、光合系统Ⅰ活性受损(见表2)，说明重度盐胁迫严重破坏了光合机构。

光化学性能指数代表以光吸收为基础的光合性能指标，是研究植物光合生理状态的重要参数。总光合性能指数代表了总光合性能指数。最大光化学效率反应桑树叶片光合作用光合系统Ⅱ反应中心光能转化效率，常用最大光化学效率下降程度反映光抑制程度的大小[20]。在正常条件下，该参数变化较小，不受物种和生长条件的影响，逆境下该参数明显下降。在本研究中，不同盐浓度时的光化学性能指数均与CK处理相比有所降低，但总光合性能指数与CK处理没有显著差异，只有重度盐胁迫处理时，最大光化学效率比CK明显下降(见表6)，说明一定的盐胁迫对植物光合机构不会造成不可逆的损伤，而重度盐胁迫对光合性能造成严重伤害，降低了桑树叶片光合系统Ⅱ反应中心的活性。

综上所述，不同浓度盐胁迫对光合机构的损伤位点不同(见图4)。

图中不同颜色方块代表不同浓度盐胁迫的最重损伤位点。紫色为轻度盐胁迫(100 mmol/L)，黄色为中度盐胁迫(150 mmol/L)，红色为重度盐胁迫(200 mmol/L)。

4 结论

盐胁迫会导致桑树光合机构受到影响。轻度盐胁迫会激发热耗散，耗散多余的热量；中度盐胁迫会激发PGR5依赖型环式电子传递，将光合系统Ⅰ过剩的电子重新循环，保护光合系统Ⅰ；重度盐胁迫时，光合系统Ⅱ和光合系统Ⅰ都受到严重损伤，这种损伤是不可逆的。