T-2毒素激活活性氧/核转录因子-κB信号通路诱导猪空肠上皮细胞发生炎性反应

康瑞芬 王 猛 沈家鲲 金晓明 李春梅

(南京农业大学动物科技学院，南京210095)

霉菌毒素是由多种自然界中真菌产生的高度多样化的次级代谢产物，会污染食物和饲料，导致人和动物霉菌毒素中毒[1]。T-2毒素属于单端孢霉烯族A类化合物，主要由镰刀菌属产生，如梨孢镰刀菌、枝孢镰刀菌、拟孢镰刀菌和三线镰刀菌等[2]。在单端孢霉烯族霉菌毒素中，虽然T-2毒素的检出率较低，但其毒性最强，且广泛存在于大麦、小麦、燕麦和玉米等谷物中[3]，严重危害家畜健康，影响畜牧业的发展，因此受到广泛关注。T-2毒素的产生及饲料和食品的污染程度与多种因素有关，如遗传因素、环境温湿度、底物温湿度和氧气含量[4]。作物在田间生长期间以及收割后储存不当均会产生T-2毒素。

T-2毒素在欧洲联盟国(EU)是谷物样品中常见的污染物，人和动物被暴露T-2毒素的风险大大增加，因此对人和动物的健康构成了威胁[5]。对来自22个欧洲国家的20 519个饲料和谷物样品进行检测，发现谷物中特别是燕麦和燕麦产品中存在T-2和HT-2毒素[6]。Gruber-Dorninger等[7]进行的10年全球饲料中真菌毒素含量调查中发现，19%的样品被T-2毒素污染。中国饲料样品中T-2毒素的污染率为79.5%，这些样品中T-2毒素的含量最高为735 ng/g[8]。Morcia等[9]报告指出，从2011年至2014年，意大利大麦样品中T-2毒素和HT-2毒素的阳性率在22%～53%。在对克罗地亚、波斯尼亚和黑塞哥维那的一项研究发现，在340个未加工燕麦样品中，T-2毒素的检出率为86.1%，T-2毒素的含量最高为304.2 μg/kg[10]。T-2和HT-2毒素也是英国有机和传统燕麦中最常检出的镰刀菌毒素，超标率分别为84%和92%[11]。

T-2毒素的主要毒性机制为通过与60S核糖体亚基上的肽基转移酶相互作用抑制蛋白质合成，诱导细胞发生核糖体应激反应，激活c-Jun N端激酶(JNK)/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，参与机体的许多生理过程，如破坏细胞稳态，抑制细胞生长和分化，引起细胞凋亡[12]。小肠是营养物质主要的吸收部位，也是抵御外界物质的第1道物理屏障，对维持动物的健康至关重要[13]。猪空肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells, IPEC-J2)是从没有喂食的新生仔猪空肠中分离的细胞系，保留了肠道上皮的性质，可作为研究肠上皮固有功能的简便模型[14]。该细胞系具备非转化、非致瘤的特点，可分泌黏液素，产生细胞因子和趋化因子[15]，表达与免疫系统相关的蛋白质，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[16]。因此，IPEC-J2被广泛用于研究外源物质对肠道免疫功能、通透性和创伤后愈合能力的影响[17-18]。Pinton等[19]发现动物摄入T-2毒素污染的饲料后，会诱发胃肠道发生坏死性病变。Goossens等[20]发现T-2毒素处理IPEC-J2，会降低细胞跨膜电阻(TEER)值，增加细胞通透性，破坏肠道屏障。Verbrugghe等[21]发现T-2毒素处理IPEC-J2，鼠伤寒沙门氏菌跨IPEC-J2单层的转运明显增加，说明细胞屏障被破坏。Romero等[22]发现T-2毒素降低结直肠腺癌细胞(Caco-2)的TEER值以及紧密连接相关基因的转录水平。

研究表明，大部分霉菌毒素的毒性由氧化应激介导[23- 24]，氧化应激会引起肠上皮细胞凋亡，诱导肠道发生炎性反应[25]。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一种含硫醇的抗氧化剂，能够有效清除活性氧(ROS)，有助于维持细胞内的氧化和抗氧化平衡[26]。据报道，NAC可以保护细胞免受氧化应激，抑制肠道损伤，降低肠道脂质过氧化和自由基水平，促进抗氧化酶活性的恢复[27]。目前，关于T-2毒素诱导的肠屏障功能异常的确切机制尚不清楚，其毒性作用是否和氧化应激有关有待验证。因此，本试验以IPEC-J2为试验对象，旨在揭示T-2毒素对肠道的损伤机理，为防御T-2毒素对人和动物肠道损伤提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞的来源与培养

IPEC-J2购买自北京北纳创联生物有限公司。细胞完全培养基由DMEM高糖培养基、10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(10 kU/mL青霉素、10 mg/mL链霉素和25 μg/mL两性霉素B)组成。将细胞在37 ℃的培养箱中培养，连续供应5%的CO2。

1.2 试验试剂及仪器

T-2毒素购自北京百灵威科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、抗生素购自美国GIBCO公司；NAC、四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒、ROS试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒和总超氧化物歧化酶(T-SOD)试剂盒均购自南京建成生物研究所；抗体核转录因子-κB(NF-κB)购自美国Abcam公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自南京擎科生物科技有限公司。

CO2细胞培养箱、全波长酶标仪购自美国Thermo公司；LSM700激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司；梯度PCR热循环仪购自日本TaKaRa公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 细胞活力测定

细胞传代后，待细胞融合度达到80%，将细胞消化下来，进行细胞计数并将细胞悬液进行稀释。细胞以1×105个/mL浓度接入96孔板，待细胞融合度达到80%，用不同浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL)的T-2毒素处理处理细胞12、24、48 h，参照MTT试剂盒说明书进行细胞活力测定，以确定适宜的T-2毒素浓度和处理时间。

1.4 试验设计与处理

以IPEC-J2为模型细胞，试验分为4个组，分别为对照组(Con组)、NAC组(4.0 mmol/L NAC)、T-2组(4.0 ng/mL T-2毒素)和T-2+NAC组(4.0 ng/mL T-2毒素+4.0 mmol/L NAC)。T-2毒素溶于二甲基亚砜(DMSO)并配制成1 mg/mL的贮存液于-20 ℃保存，用基础培养基稀释到4.0 ng/mL并于4 ℃保存。NAC用灭菌双蒸水配制成0.5 mmol/L的贮存液，置于4 ℃保存。将消化后的细胞以均等浓度接种到96孔板或6孔板(不同试验，接种板不同)，当细胞融合度达到80%时，用含有相应试剂的培养基替代基础培养基，继续培养12 h，进行后续试验操作。

1.5 实时荧光定量PCR检测炎症相关基因的相对表达量

细胞以2×105个/mL浓度接入6孔板，待细胞融合度达到80%，用T-2毒素和NAC溶液处理细胞12 h后，吸掉培养基，PBS清洗3次，每孔加1 mL Trizol，将细胞裂解下来，裂解液和细胞一起装入2 mL离心管，离心机离心(4 ℃，3 500 r/min，15 min)。取上清液放入新的2 mL离心管，加0.2 mL氯仿混匀静置5 min，放入离心机离心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)，取上清液放入新的2 mL离心管，与上清液等体积加入异丙醇，混匀静置10 min，离心机离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)。弃去上清，加入1 mL 75%乙醇轻轻震荡洗涤沉淀，离心机离心(4 ℃，7 500 r/min，5 min)。弃去上清，将装有沉淀的离心管放入超净台，打开分机吹干沉淀，加入50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀并用枪轻轻吹打均匀。测定细胞RNA浓度后，按照2×TSINGKE Master Mix反转录试剂盒说明书对RNA进行反转录，获得cDNA；测得cDNA浓度后，将各样品cDNA浓度稀释到100 ng/μL，cDNA放于-20 ℃保存用于后续试验。按照2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)试剂盒说明书加入各反应试剂，在实时荧光定量PCR仪上进行检测。试验数据采用2-△△Ct法进行相对定量计算，各个基因引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 细胞ROS水平测定

首先将细胞爬片放入12孔板，打入100 μL浓度为2×105个/mL的细胞悬液，待细胞贴壁后，再打入1 mL培养基，培养至细胞融合度达到80%，用T-2毒素和NAC溶液处理细胞12 h，测定细胞ROS水平，测定方法参照ROS检测试剂盒说明书。

1.7 细胞抗氧化指标检测

细胞以2×105个/mL浓度接入6孔板，待细胞融合度达到80%，用T-2毒素和NAC溶液处理细胞12 h后，用细胞刮板将细胞刮下来，和培养基一起放入新的2 mL离心管，离心机离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，收集上清液，放于-20 ℃保存。测定细胞T-SOD、CAT活性和MDA含量，测定方法参照相应的试剂盒说明书。

1.8 免疫荧光检测蛋白相对表达量

首先将细胞爬片放入12孔板，打入100 μL浓度为2×105个/mL的细胞悬液，待细胞贴壁后，再打入1 mL培养基，培养至细胞融合度达到80%，用T-2毒素和NAC溶液处理细胞12 h。吸出培养基，每孔加入1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，置于摇床上清洗3次，每次5 min；移除PBS，加1 mL 4%多聚甲醛，室温固定1 h，吸掉多聚甲醛，加入PBS，摇床清洗，重复3次，每次5 min；加入100 μL TritonX-100(0.5%)通透10 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入1 mL 1%牛血清白蛋白(BSA)，室温封闭1 h；滴加50 μL一抗到盖玻片上，于湿盒中避光孵育(37 ℃，1 h)；PBS清洗3次，每次5 min；滴加50 μL Alexa Fluor 488标记的二抗，于湿盒中避光孵育(37 ℃，1 h)；吸掉二抗，加入PBS，摇床清洗，重复3次，每次5 min；滴加50 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，湿盒中避光孵育(室温，10 min)，PBS清洗3次，每次5 min；载玻片上滴加荧光抗淬灭剂，将细胞爬片倒置在载玻片上进行封片，激光共聚焦显微镜检测荧光强度并拍照记录。

1.9 数据统计与分析

数据分析用GraphPad Prism 6.01软件完成。首先进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Tukey多重比较检验，结果表示为平均值±标准误(mean ± SE)。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 T-2毒素对IPEC-J2活力的影响

为了确定T-2毒素对IPEC-J2的毒性，用不同浓度的T-2毒素(0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL)处理细胞12、24、48 h后检测细胞活力。如图1所示，随着T-2毒素浓度增加，细胞活力降低，且处理时间越长，细胞活力越低。与0 ng/mL T-2毒素相比，1.5、2.0、3.0和4.0 ng/mL T-2毒素处理细胞12、24、48 h后，细胞活力显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。其中，4.0 ng/mL T-2毒素处理细胞12 h后，细胞活力为74.5%；处理细胞24 h后，细胞活力为49.5%；处理细胞48 h后，细胞活力低至45.5%。因此，本试验选择的T-2毒素浓度和处理时间分别为4.0 ng/mL和12 h。

*表示与0 ng/mL T-2毒素相比差异显著(P<0.05)，**表示与0 ng/mL T-2毒素相比差异极显著(P<0.01)。

2.2 抗氧化剂NAC浓度筛选

如图2所示，与对照组相比，T-2组细胞活力极显著降低(P<0.01)；T-2+1 mmol/L NAC、T-2+2 mmol/L NAC、T-2+4 mmol/L NAC组细胞活力均无显著差异(P>0.05)。T-2+4 mmol/L NAC组细胞活力高于T-2+1 mmol/L NAC和T-2+2 mmol/L NAC组(P>0.05)。因此，本试验选择4 mmol/L NAC作为后续试验浓度。

1、2、4 NAC分别表示1、2、4 mmol/L NAC；**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

2.3 T-2毒素对IPEC-J2中炎症相关基因表达的影响

如图3所示，与对照组相比，T-2组IPEC-J2中TNF-α mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，NAC、T-2和T-2+NAC组IPEC-J2中白细胞介素-6(IL-6)mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)，T-2+NAC组IPEC-J2中白细胞介素-10(IL-10)mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。

2.4 T-2毒素对IPEC-J2中ROS水平的影响

如图4所示，与对照组相比，T-2组IPEC-J2中ROS水平极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比，T-2+NAC组IPEC-J2中ROS水平显著降低(P<0.05)。

2.5 T-2毒素对IPEC-J2中抗氧化指标的影响

如图5所示，与对照组相比，T-2组IPEC-J2中CAT和T-SOD活性极显著降低(P<0.01)，IPEC-J2中MDA含量极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比，T-2+NAC组IPEC-J2中CAT和T-SOD活性极显著升高(P<0.01)，IPEC-J2中MDA含量极显著降低(P<0.01)。

*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下图同。

#表示与T-2组相比差异显著(P<0.05)，##表示与T-2组相比差异极显著(P<0.01)。下图同。

图5 T-2毒素对IPEC-J2中抗氧化指标的影响

2.6 T-2毒素对IPEC-J2中NF-κB蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组相比，T-2组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比，T-2+NAC组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。

3 讨 论

肠道是机体的第1道物理屏障，动物摄入被霉菌毒素污染的饲料后，胃肠道可能暴露于高浓度的霉菌毒素中，引起胃肠道损伤。IPEC-J2是一种永生的肠细胞系，可在体外保持分化特征，与原代肠上皮细胞高度相似[28]。此外，IPEC-J2保留了其上皮的性质，可模拟肠道上皮先天免疫功能，分泌黏蛋白，产生细胞因子和趋化因子[15]，常被用于研究肠道病原体与宿主的相互作用、猪特异性病原体的生成以及先天免疫反应[16,29]。

图6 T-2毒素对IPEC-J2中NF-κB蛋白表达的影响

体外细胞活力测定在预测毒素毒性中起着核心作用。研究表明，不同浓度的T-2毒素处理IPEC-J2，细胞活力显著降低，而且T-2毒素浓度越高，细胞活力越低[20]，这与本试验的研究结果一致。细胞氧化应激主要表现为细胞ROS水平增加，抗氧化能力降低，如T-SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶活性降低，MDA含量增加，脂质过氧化程度增加[30]。在本试验中，T-2毒素极显著降低了IPEC-J2中CAT和T-SOD活性，极显著升高了IPEC-J2中MDA含量，极显著增加IPEC-J2中ROS水平，从而导致氧化应激并使细胞发生炎性反应。与T-2毒素单独处理相比，T-2+NAC处理可以极显著降低IPEC-J2中ROS水平，极显著升高IPEC-J2中CAT和T-SOD活性，极显著降低IPEC-J2中MDA含量，减缓细胞的氧化应激和炎性反应。上述结果表明，T-2毒素诱导IPEC-J2发生炎性反应主要通过诱导ROS的过量产生，破坏氧化平衡，导致肠上皮细胞发生氧化应激。

NF-κB参与诱导多种基因的表达，在调控肠道免疫和炎性反应的多种基因的表达中起着核心作用。细胞因子和病原体刺激细胞表面受体启动信号级联反应，从而激活NF-κB驱动细胞增殖以及抗坏死因子分子和细胞因子释放，以激活免疫应答[31]。同时，NF-κB调控不同类型的免疫细胞的分化，驱动单核细胞分化为巨噬细胞，M1巨噬细胞产生白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、TNF-α和其他促炎细胞因子，M2巨噬细胞产生抗炎因子IL-10[32]。IL-6是典型的多效细胞因子，由淋巴样和非淋巴样细胞(包括上皮细胞、成纤维细胞和肌肉细胞)产生，参与调控免疫应答，在许多类型的肠道炎症和手术损伤中均观察到IL-6的过量表达[33-34]。在本试验中，T-2毒素处理IPEC-J2 12 h后，NF-κB蛋白相对表达量极显著增加，细胞中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量显著或极显著升高，这与其他霉菌毒素对IPEC-J2的研究结果[25]一致。与T-2组相比，T-2+NAC组的IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著降低，抗炎因子IL-10的mRNA相对表达量升高，TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量降低。以上研究结果表明，T-2毒素诱导IPEC-J2产生过量ROS，从而激活NF-κB蛋白的表达，促进炎症因子的释放，引起炎性反应。如图7所示，T-2毒素通过ROS/NF-κB信号通路诱导IPEC-J2发生炎性反应。

IPEC-J2：猪空肠上皮细胞 intestinal porcine epithelial cells；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸 N-acetyl-L-cysteine；ROS：活性氧 reactive oxygen species；NF-κB：核转录因子-κB nuclear factor-κB；IL-6：白细胞介素-6 interleukin-6；IL-10：白细胞介素-10 interleukin-10；TNF-α：肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-α。

4 结 论

T-2毒素通过诱导IPEC-J2产生过量的ROS，促进炎症相关基因和NF-κB蛋白的表达，导致IPEC-J2发生炎性反应。当利用NAC抑制细胞产生ROS，可明显抑制T-2毒素诱导的细胞炎性反应。