胃尔康改善肿瘤坏死因子α诱导人胃上皮GES-1细胞炎症和肠化的研究

怀佳萍 陈燕萍 丁进 叶晓华 陈跃华*

胃黏膜肠上皮化生（IM）是从慢性胃炎、萎缩到异型增生、腺癌的胃癌级联反应过程的中间阶段，是胃的癌前病变［1］。目前已有研究表明IM与胃癌的发病呈正相关［2］。MUC2是一种分泌型黏蛋白，在正常胃黏膜中不表达，但在肠化的胃黏膜中表达。SOX2是胃特异性转录因子，对胚胎干细胞的分化、形态改变具有重要意义，在消化道肿瘤如食管癌、胃癌、结直肠癌等中均有异常表达。在IM过程中，MUC2表达量呈逐渐增多趋势，而SOX2表达则逐渐减少［3］。已有学者证实胃尔康能降低实验性大鼠胃癌前病变的发生率。本实验通过体外炎症细胞模型的建立，观察胃尔康对MUC2和SOX2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 （1）细胞来源：由源培生物细胞库提供人胃黏膜上皮细胞系GES-1，用含10%血清白蛋白1640培养基为常规培养基，并置于37℃、5% CO2培养箱中培养。（2）药物：胃尔康成分为党参、天花粉、乌梅、五味子、山楂、木香、马钱子粉等，由浙江家和制药有限公司提供（国药准字Z10970120），以PBS溶解成浓度为16 mg/ml的母液待用。人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）购于Peprotech公司，配置母液浓度为1 mg/ml备用。

1.2 方法 （1）分组：本实验分为四组：空白组（GES-1）、对照组（GES-1+PBS溶液）、模型组（GES-1+TNF-α）、治疗组（GES-1+ TNF-α+胃尔康）。其中模型组在TNF-α溶液刺激下培养24 h，治疗组则在TNF-α溶液刺激8 h后再加入胃尔康溶液培养16 h。（2）细胞增殖抑制试验（MTT还原法）：在96孔细胞培养板（5000个细胞/孔）中接种GES-1细胞，经过24 h常规培养后，分别加入浓度为0、1、5、10 ng/μl的TNF-α溶液继续培养24 h。培养结束时每孔加入10 μl CCK-8，在培养箱中继续孵育2 h，酶标仪测量各组在450 nm处吸光值。根据平均光密度（OD）计算细胞活力的百分比：细胞活力百分比=OD处理组/OD对照组100%。用同样方法在GES-1细胞中分别加入浓度为0、10、20、40、80、160 μg/ml的胃尔康溶液，并计算细胞活力。实验至少各重复3次。（3）IL-22含量测定：在6孔培养板中（5万个/孔）接种GES-1细胞，根据MTT还原法确定TNF-α和胃尔康浓度对细胞进行相应处理，细胞上清液中IL-22含量则由ELISA法测定。（4）MUC2和SOX2蛋白表达测定：在6孔培养板中（5万个/孔）接种GES-1细胞，同理根据MTT还原法确定的TNF-α和胃尔康浓度对细胞进行相应处理，用western blot法测定MUC2和SOX2蛋白表达。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 17.0统计软件。计量资料（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较则采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT还原法结果 GES-1细胞分别加入不同浓度的TNF-α刺激后，细胞活性无明显变化，即不同浓度TNF-α对细胞无明显损害，亦无促细胞增长作用，故后续实验选择5 ng/ml浓度进行。不同浓度胃尔康刺激后与对照组比较，差异无统计学意义，故选择对细胞既无明显抑制也无促进作用的浓度40 μg/ml作为后续实验浓度。

2.2 胃尔康治疗后GES-1细胞形态学变化 空白组和对照组GES-1细胞生长良好，多数呈圆梭形，大小一致，核圆，呈小岛状生长，逐渐扩大成片，均贴壁生长，多为不规则的多角形（见图1A、B）。模型组加入TNF-α培养后表现为细胞变圆，边界不清，肿胀，间隙增宽，呈分枝状、核质融合状态，圆形漂浮细胞和细胞碎片增多（见图1C）。治疗组加入胃尔康后GES-1表现为贴壁细胞逐渐增多，细胞形态逐渐复原（见图1D）。

图1 各组GES-1细胞生长状态和形态显微镜下改变（×200）

2.3 各组IL-22含量比较 见表1。

表1 各组IL-22含量比较（±s）

表1 各组IL-22含量比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别 n IL-22（pg/ml）空白组 12 55.9±16.4对照组 12 58.1±9.8模型组 12 86.5±13.9*治疗组 12 67.8±11.0#

2.4 MUC2和SOX2蛋白表达 本实验中空白组灰度值默认为1，以此得出相应对照组、模型组和治疗组的灰度值。结果显示对照组中MUC2和SOX2蛋白表达与空白组比较无明显变化，差异无统计学意义。与对照组比较，模型组中MUC2蛋白含量明显升高，通过胃尔康治疗后MUC2蛋白表达有所下降，差异均有统计学意义。而模型组中SOX2蛋白表达明显少于对照组，治疗组中则有所升高，差异均有统计学意义。见表2、图2。

表2 各组MUC2和SOX2蛋白比较（±s）

表2 各组MUC2和SOX2蛋白比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别 n MUC2 SOX2空白组 12 1 1对照组 12 1.12±0.33 1.06±0.40模型组 12 2.60±0.28* 0.48±0.29*治疗组 12 1.59±0.15# 0.74±0.31#

图2 各组中MUC2和SOX2蛋白表达

3 讨论

每年全球有近80万患者因胃癌死亡，其中约50%患者来自中国［4］。IM与胃癌发生率密切相关这一观点已被大量研究证实，而慢性萎缩性胃炎合并IM已被WHO定义为胃癌前期状态。但已有学者证实IM具有潜在的可逆性，在特定的情况下是可以被清除或逆转的［5］，因IM是机体对环境变化做出的一种适应性改变，其能随环境改变而变化。

目前采用中医药治疗慢性萎缩性胃炎取得一定成绩，不仅能改善症状，且能减轻病理炎症反应［6］。IM属于中医学理论中“胃脘痛”“胃痞”等范畴，有学者研究发现加味香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎有较好疗效，能减轻胃黏膜萎缩，部分逆转肠化生情况［7］。胃尔康有益气健脾、滋肝补肾、清热解毒作用，能有效治疗慢性萎缩性胃炎脾胃阴虚证者［8］，治疗总有效率>95%，并能部分逆转IM及不典型增生。IL-22在人体内主要是由Th1、Th17、Th22等活化CD4+T细胞所分泌，能有效缓解炎性疾病中相关炎症反应，但IL-22又能促进增殖和抗凋亡为主的疾病的发生发展［9］。徐芳媛等［10］发现在胃癌恶性转化过程中，存在IL-22自分泌现象，且在慢性胃炎经胃癌前病变至胃癌的恶性转化过程中IL-22表达量逐渐升高。本资料结果显示，模型组与对照组比较IL-22水平显著增高，胃尔康干预后IL-22水平显著降低，提示胃尔康通过抑制炎症因子IL-22的释放，从而减轻机体组织炎症反应。

IM是指正常胃黏膜被上皮样肠黏膜所取代的形态学改变。慢性萎缩性胃炎合并IM已被归纳为胃癌癌前病变，在IM中估计每年有0.13%～0.25%患者存在胃癌风险［11］。MUC2是一种高分子量糖蛋白，广泛存在于人体管腔器官上皮细胞中，其表达量的变化与细胞分化和肿瘤发生发展有密切关系。研究指出，MUC2大量表达于肠上皮胃黏膜的杯状细胞中，而在正常胃黏膜细胞中不表达，其在胃癌组织中阳性表达率51.4%，因此，MUC2黏蛋白与胃癌发生发展有密切关系。SOX2与胃黏膜分化发育和表型有一定相关性，已有研究表明，SOX2表达情况与胃癌侵袭深度、淋巴结转移或淋巴管浸润存在相关性。亦有多项研究报道，SOX2异常表达于结直肠癌组织中［12］。本实验中检测GES-1细胞中MUC2和SOX2蛋白的表达，发现TNF-α刺激后GES-1细胞MUC2表达明显升高，而SOX2表达下降。通过胃尔康治疗后，MUC2表达下降，同时SOX2的表达上升，表明胃尔康可能在一定程度上能逆转IM的发展。莫耘松等［13］发现胃尔康能改善慢性萎缩性胃炎患者免疫功能。陈芝芸等［14］动物实验亦发现胃尔康对实验性大鼠胃黏膜萎缩有显著改善作用。这些研究均与本资料结果相一致。综上所述，胃尔康可能是通过下调MUC2表达和上调SOX2表达来改善甚至逆转IM进程，这也可能是胃尔康在治疗慢性胃炎方面的分子生物学机制之一。