江西省吉水县柑桔黄龙病菌检测

张凯东，强 遥，鄢明峰，贺 哲，虞凡霜，叶 莹，蒋军喜

(江西农业大学农学院，南昌， 330045)

柑桔黄龙病又称柑桔黄梢病、柑桔青果病，是世界柑桔生产上极具毁灭性的病害，属国内外重要检疫对象[1]。该病广泛分布于亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50余个国家和地区，在我国则分布于海南、广东、广西、福建、台湾、云南、贵州、四川、浙江、江西和湖南11个省(自治区)[2]。柑桔黄龙病的病原包括韧皮部杆菌属中3种细菌，即亚洲韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)、非洲韧皮部杆菌(C. Liberibacter africanus, CLaf)和美洲韧皮部杆菌(C. Liberibacter americanus, CLam)[3-5]，我国的柑桔黄龙病菌为CLas[6]。

江西柑桔黄龙病最初于1978年在赣州市的安远、大余等县发生，之后随着柑桔苗木的频繁调运和柑桔木虱的逐渐北移，该病已扩散蔓延到赣南的各县市区，吉安的遂川、万安、泰和3县[7]，以及抚州的广昌、南丰2县[8]。近年来，在吉安的吉水县也陆续出现了柑桔黄龙病的疑似病株。为了确诊吉水县柑桔黄龙病疑似病株的病原，我们采用PCR和序列测定技术进行了柑桔黄龙病菌检测，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集2019年12月从吉水县6个柑桔园共采集10份疑似柑桔黄龙病症状叶片样品和2份无症但怀疑已感染叶片样品带回室内检测，每份样品分别来自不同的植株。样品具体信息见表1，症状特征见图1。

表1 在江西省吉水县采集的柑桔黄龙病待测样品的相关信息

注：各编号对应信息见表1。图1 在江西省吉水县采集的柑桔黄龙病待测叶片样品

1.2 样品总DNA提取采用Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒，按其说明提取样品总DNA。提取的DNA最后溶于50 μL Buffer TE中，并于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增引物根据文献[9]，选用柑桔黄龙病菌亚洲种特异性引物A2/J5对病样进行PCR检测。5’端引物(A2)序列为：5’-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3’；3’端引物(J5)序列为：5’-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’。扩增片段长度预计703 bp，为部分核糖体蛋白基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PCR扩增及序列测定PCR反应总体系25 μL，包括A2/J5各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后一次循环后72 ℃延伸10 min。获得的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序。用计算机分析软件 DNAStar (Madison Wisconsin, USA) 处理所测序列，整理后的序列递交到NCBI数据库与已有序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 DNA提取及PCR扩增采用试剂盒法从待测的12个样品和阴性、阳性样品中，均提取到了高质量的基因组总DNA。以提取的DNA为模板，用亚洲黄龙病菌特异性引物A2/J5进行PCR扩增，结果从第5、7、8、9、11、12号样品和阳性对照中扩增到符合预期大小约703 bp的条带，而从其他6个样品和阴性对照中均未扩增到相应的条带(见图2)。

注：M为DNA marker，1—12对应信息见表1，阴为健康植株扩增结果，阳为患病植株扩增结果。图2 样品PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳

2.2 序列测定及同源性分析将出现扩增条带的6个样品(命名为JS-5、JS-7、JS-8、JS-9、JS-11和JS-12)的PCR产物送至上海生工生物有限公司进行测序，返回的测序结果经DNAStar拼接后得到长度为703 bp的序列(包含了两端引物序列)。经DNAStar进行序列比对，这6个样品的序列完全相同，序列已递交至GenBank，登录号为MT274584—MT274589。与GenBank中已有序列进行同源性比较，这6个样品的序列与柑桔黄龙病亚洲种对应序列(基因登录号：CP001677)的同源性均为100%。

3 讨论

近年来，江西省吉水县多个柑桔园的植株陆续出现叶片黄化和斑驳等疑似黄龙病的症状。为了明确该地区柑桔黄龙病的发生情况，利用PCR扩增和序列测定技术对采集的12份疑似黄龙病的样品进行了病原检测。结果，从6个样品中检测到柑桔黄龙病菌，表明吉水县已有黄龙病发生。黄龙病的存在，对该县的柑桔产业是个潜在的威胁，希望能引起当地有关部门的高度重视。

柑桔黄龙病的叶片症状有不对称斑驳黄化、均匀黄化和缺素状黄化3种类型，果实有红鼻果等症状，通常认为叶片不对称斑驳黄化和红鼻果是柑桔黄龙病特有的症状并作为田间诊断黄龙病的依据[10-11]。在本研究中，呈现为不对称斑驳黄化症状的叶片样品均检测出黄龙病菌，这印证了柑桔黄龙病叶片不对称斑驳黄化症状确实具有特异性。