枸橼种质对柑橘溃疡病的抗性鉴定*

朱志媚，谭李梅，徐 静，符红艳，胡 哲，龚 蕾，杨贵兵，王 萍，马先锋，邓子牛

（1 湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128）（2 国家柑橘改良中心长沙分中心）（3 郴州市农业科学研究所）

柑橘溃疡病是阻碍柑橘产业发展的世界性检疫病害，是由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanth-omonas citrisubsp.citri，Xcc）引起的[1]。选育抗病品种是防治溃疡病的有效途径，科学家在过去几十年一直在寻找抗溃疡病的柑橘品种，但发现几乎所有柑橘属的栽培种接种Xcc 后均表现感病症状。对不同柑橘品种的抗溃疡病能力分析发现，橙类、柚类、柠檬等商用品种表现为不同程度的感病[2]，只有金柑属的种质表现为抗溃疡病[3-5]，故此前的抗溃疡病育种多用金柑属品种作抗性材料进行研究[6-7]。但金柑属和柑橘属2 个不同属的遗传差异较大，用金柑类抗性资源与柑橘属品种杂交，很难获得农艺性状符合柑橘商品化生产需求的抗性品种，因此柑橘属品种的抗溃疡病研究进展缓慢。

为寻找柑橘属的抗性资源，丰富的野生柑橘种质提供了可能性。野生柑橘种质具有较强抗性，一般在田间不表现溃疡病症状，接种溃疡病菌后多会表现症状，但因其长期处在野生状态，与栽培品种杂交很难获得品质优良的抗病品种。经过10 余年的筛选，Deng 等[8]鉴定出柑橘属独特的抗溃疡病种质枸橼C-05（Citrus medicaL.），为防治柑橘溃疡病研究提供了重要的柑橘属种质。

枸橼又名香橼，与柚（C.grandisOsbeck）和宽皮柑橘（C.reticulataBlanco）被认为是柑橘属种类品种起源的原始种[9-10]。枸橼被认为起源于印度东北部及其邻近地区[11]，但是，后来陆续发现我国也是枸橼的起源中心之一，先后在我国报道枸橼种质有11 个类型，包括变种、品种和杂种[12]。枸橼也是最早传入欧洲的柑橘资源，引入欧洲后又衍生了不同的枸橼种质[11]，因此，长期的演化形成了丰富的遗传多样性。但是在柑橘物种的形成过程中，枸橼一直只作父本[10-13]，可能使得枸橼保存了原初的抗性。Das[14]指出枸橼可能是一种抗溃疡病资源；通过田间活体针刺接种法接种溃疡病菌，胡青波等[15]发现其对溃疡病的抗病性表现差异。长期的人工接种和田间自然接种结果显示枸橼C-05 是柑橘属独特的抗溃疡病种质，为了进一步探明枸橼C-05 的抗病机理，需要对更多的枸橼类种质进行抗病性评价。本研究收集了14 份枸橼种质，初步比较了它们的叶片形态学特征，以显示枸橼之间的种质多样性，进而对其进行离体和活体接种溃疡病菌，全面评价其抗病性，以期获得更多的抗病种质资源，为后续抗病基因的挖掘和枸橼抗病机理的探究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以枸橼C-05 和园香橼、矮果香橼、美国枸橼、丹娜香橼、普通香橼、南川香橼、长果香橼、木里香橼、小香橼、野生香橼、大香橼、印度大果、爪哇柠檬14 份枸橼种质为试材（表1），以极感病种质‘冰糖橙’为对照。所有参试种质均从国家柑橘改良中心长沙分中心、国家柑橘资源圃（重庆）采集接穗，嫁接在枳砧上，在病理温室培育2 年后用于形态学观察和溃疡病菌接种鉴定。

表1 参与鉴定的14 份枸橼种质和对照‘冰糖橙’的名称和来源

1.2 叶片形态学的观察

在枸橼种质的1 年生春梢上采取生长一致、达到最大叶面积时的叶片，每株测定3 片叶，单叶重复。观测叶片形状、有无翼叶，用游标卡尺测量叶片最大长度和最大宽度、叶尖长度（叶片靠叶尖部1/3 处长度）和叶尖宽度（叶片靠叶尖部1/3 长度处的宽度），并计算叶形指数（叶长/叶宽）、叶尖指数（叶尖长/叶尖宽）[16-17]。

1.3 柑橘溃疡病菌的制备

将已保存的溃疡病菌 XccDL509 菌系[18]从-80 ℃超低温冰箱取出，然后通过划线接种于LB固体培养基（含10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化钠、15 g/L 琼脂），在28 ℃的恒温箱中培养72 h 左右，挑取单菌落至20 mL 的LB 液体培养基中培养，在28 ℃和200 r/min 摇床中振荡培养18～24 h，将得到的菌液通过分光光度计调整OD600至1.0[19]。用无菌水重悬菌体，并用平板计数法计算菌液浓度后[20]，继续用无菌水调节菌液浓度至103、104、105、106cfu/mL，用于接种。

1.4 离体注射接种

每个种质采集3 片生长一致、达到最大叶面积之前的新叶，放入自封袋并做好标记。接种前用酒精棉擦拭叶片正、背面，待酒精挥发后，将叶片轻轻翻转呈叶背朝上，用1 mL 注射器将重悬溃疡病菌液注入叶肉组织。每个点注射的量以两侧脉间的叶肉组织完全浸润为准（注射量约为10 μL）[19]。每片叶注射5 个点，分别注射103、104、105、106cfu/mL和无菌水，注射后均用吸水纸擦干叶表残留菌液。叶片注射结束后，将材料统一放置在垫有湿润滤纸的培养皿中，在叶柄处包裹湿润棉花，将培养皿置于（28±2）℃、光照强度为2 000～3 000 lx、光周期为16 h/d 的植物培养室中，持续20 d 观察其发病情况。离体接种试验重复2 次。

1.5 活体注射接种

每个种质在嫁接生长良好的活体植株上，选择3 片达到最大叶面积前的新叶，直接在叶片上接种溃疡病菌，活体注射接种与离体注射接种方法一致，注射结束后，将材料统一放置在温度为（28±2）℃、空气相对湿度为60%～80%的病理温室中持续观察30 d，并统一肥水管理。活体接种试验重复6 次。

1.6 离体与活体接种病情指数统计及分级

接种后定期观察病情的发展进程，离体接种观察到接种后第20 d，活体接种观察到接种后第45 d。参考崔华威等[21]的方法，采用Photoshop 和游标卡尺分别统计103、104、105、106cfu/mL 溃疡病菌接种区域的典型病斑数量、病斑大小，并计算病斑面积占接种区面积的比率，没有典型病斑的抗性反应区的坏死斑点数、坏死斑面积及其与接种区面积比率也进行统计和计算，但不作为典型病斑计入。分别赋予典型病斑数量、病斑区与接种区比率权重为0.5、0.5，根据病斑数量、病斑区与接种区比率，对溃疡病的抗性病症级别均可分为0、1、2、3、4、5 级。参考李建挥[22]的方法，统计每个浓度的病情指数、综合病情指数，计算平均综合病情指数。

病情指数＝［∑（该级病叶数×该级代表值）/（调查叶片数×发病最高级代表值）］×100

综合病情指数＝（典型病斑数量的病情指数×0.5）+（病斑区与接种区比率的病情指数×0.5）

根据平均综合病情指数，将枸橼种质分为以下5 类：极抗（HR），病情指数＜10；抗病（R），10≤病情指数≤30；感病（S），30＜病情指数≤70；极感（HS），病情指数＞70。

1.7 数据分析

试验数据运用SPSS 17.0 软件进行统计和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 枸橼种质叶片形态差异比较

对14 份枸橼种质生长一致、达到最大叶面积的叶片进行形态学观察，供试14 份枸橼种质新叶颜色均为绿色，多数枸橼种质均无明显翼叶，只有木里香橼有较大翼叶，印度大果有较小的翼叶。叶片形状差异较大（图版2-A、表2），其中园香橼、矮果香橼、丹娜香橼、长果香橼、小香橼、大香橼、印度大果、爪哇柠檬的叶片形状较相似，呈卵圆形；枸橼C-05 与美国香橼、普通香橼、南川香橼、野生香橼的叶片呈长椭圆形；木里香橼的叶基部宽，呈近梨形。部分枸橼种质之间的叶形指数与叶尖指数存在显著差异，枸橼C-05 和大香橼的叶形指数与叶尖指数最大，小香橼、印度大果和爪哇柠檬的最小（表2）。供试14 份枸橼种质叶片形态存在差异，表明枸橼种质之间具有多样性，这种差异也可能决定它们对溃疡病的抗感性差异。

2.2 枸橼种质离体接种的观察与抗性综合评价

枸橼种质在离体接种溃疡病菌后，定期观察叶片症状至第20 d，在接种103cfu/mL 的溃疡病菌后，丹娜香橼、长果香橼和小香橼的发病程度最严重，接种反应为成片病斑，并在接种柑橘溃疡病菌区域出现病斑凸起，病症级别在4～5 级，病斑区占接种区面积的64.80%～84.95%，比感病品种‘冰糖橙’症状还严重；其次发病程度较严重的是南川香橼、木里香橼、野生香橼、大香橼、爪哇柠檬，接种区出现点状病斑，病斑周围带有明显黄色晕圈，病斑区占接种区面积的0.59%～20.75%，病症级别为1～2 级，与感病品种‘冰糖橙’病症相似；矮果香橼接种区出现叶面内陷，接种反应为大片坏死；园香橼、美国枸橼的接种区出现成片变色，是细胞坏死的表现；枸橼C-05、普通枸橼和印度大果的接种区病斑褐化，接种反应为点状坏死（图版2-B，表3）。

表2 14 份枸橼种质叶片形态特征

表3 枸橼种质离体接种溃疡病平均综合病情指数分析

在104cfu/mL 及更高浓度溃疡病菌接种区域观察发现，丹娜香橼、长果香橼和小香橼的发病程度更严重；其次是南川香橼、木里香橼、野生香橼、大香橼、爪哇柠檬，与‘冰糖橙’一样，病症加重；园香橼、美国香橼、普通枸橼和印度大果与抗病种质枸橼C-05 相似，表现出组织坏死，坏死部分随接种浓度增高而加大（图版2-B，表3）。

综合比较离体接种各浓度溃疡病菌的症状及其平均综合病情指数发现，枸橼C-05、园香橼、矮果香橼、美国枸橼和普通枸橼的综合病情指数为0，为极抗病类；印度大果的平均综合病情指数在20～30 范围内，属于抗病类；木里香橼和大香橼的综合指数在50～70 范围内，属于感病类；丹娜香橼、南川香橼、长果香橼、小香橼、野生香橼、爪哇柠檬和‘冰糖橙’的平均综合病情指数高于70，表现为极感病（表3）。

2.3 枸橼种质活体接种的观察与抗性综合评价

枸橼种质活体接种溃疡病菌后，每天观察叶片的症状至接种后第45 d。接种后第9 d（图版3-C），多数种质在低浓度菌液（103、104cfu/mL）接种区域开始表现反应，高浓度菌液（105、106cfu/mL）接种区域有较大面积的反应区域，但是还不能清晰地辨别抗病反应和感病症状；到接种后第15 d（图版3-D），不同菌液浓度接种后的组织坏死等抗病反应和病斑凸起等感病症状已经比较明显，初步可以辨别抗病和感病种质，但仍然不是很清晰；至接种后第25 d（图版3-E），抗病反应和感病症状已经稳定，后续的观察没有抗病或感病程度的变化，因而以接种后第25 d 的观察结果为最终判定，确定不同枸橼种质的抗病、感病程度。

接种后第25 d，接种103cfu/mL 溃疡病菌后，丹娜香橼和大香橼的发病最快，发病程度最严重，接种反应为6 个以上的点状病斑，并在接种柑橘溃疡病菌区域出现火山口状或点状病斑凸起，出现病斑破裂，病症级别在3～4 级，病斑面积占接种区面积的9.97%～20.70%，比感病品种‘冰糖橙’发病还严重；其次发病程度较严重的是南川香橼、长果香橼、木里香橼、野生香橼和爪哇柠檬，接种区出现1～4 个点状病斑，病斑周围带有明显黄色晕圈，病斑面积占接种区面积的0.56%～10.70%，病症级别为2 级，与感病品种‘冰糖橙’的病症相似；小香橼出现点状病斑凸起，病斑面积占接种区面积的0.96%，病症级别为1 级；园香橼、矮果香橼、美国香橼和印度大果的接种区出现病斑褐化，为点状病斑坏死，与极抗病种质枸橼C-05 相似；普通枸橼在接种区无明显病斑（图版3-E，表4）。

表4 枸橼种质活体接种溃疡病平均综合病情指数分析

在104cfu/mL 溃疡病菌及更高浓度溃疡病菌接种区域观察发现，丹娜香橼、南川香橼、长果香橼、木里香橼、野生香橼、大香橼、爪哇柠檬与‘冰糖橙’一样，发病程度更严重；其次是小香橼病症加重；园香橼、矮果香橼、美国香橼、普通枸橼和印度大果与极抗病种质枸橼C-05 相似，表现出组织坏死，坏死部分随接种浓度增高而加大，高浓度接种区域最终表现褐化失色（图版3-E，表4）。

综合比较活体接种各浓度症状及其平均综合病情指数发现（表4），园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼、印度大果的综合病情指数均为0，与枸橼C-05 抗病性接近，属于极抗病；其他枸橼种质对溃疡病皆表现为感病或极感病，其中小香橼的综合病情指数介于50～70 之间，属于感病，丹娜香橼、南川香橼、长果香橼、木里香橼、野生香橼、大香橼、爪哇柠檬的综合病情指数都在70 以上，与‘冰糖橙’相似，属于极感病。

2.4 枸橼种质活体接种的叶片病症分析

在活体接种溃疡病菌后第25 d，以104cfu/mL溃疡病菌接种枸橼种质的症状，分析了不同枸橼表现的症状特征，测量了接种区域的单个独立病斑的大小（图1），结果显示，大香橼和丹娜香橼病斑最大，火山口状凸起的典型症状的病斑直径在4.5 mm 以上，病斑融合，有明显的黄色晕圈；爪哇柠檬、野生香橼、长果香橼、南川香橼与‘冰糖橙’相似，也形成典型的火山口状凸起，并带有黄色晕圈，溃疡病病斑直径在3.5 mm 以上，并有病斑融合成大病斑块的现象；小香橼出现火山口状凸起病斑，直径为2.5～3.0 mm，但未发现明显的融合现象；木里香橼病斑直径为1.7 mm，病斑突起但没有黄色晕圈；印度大果、矮果香橼和园香橼褐化坏死病斑直径为1.5～2.5 mm，未形成火山口状溃疡病症状；美国枸橼和普通枸橼的坏死病斑直径在1.5 mm 以下；而枸橼C-05 在104cfu/mL 接种区域只表现出坏死的颗粒状斑点。

图1 枸橼种质活体接种在25 d 时病斑大小

3 讨论与结论

本研究对不同枸橼种质的离体与活体接种溃疡病菌的鉴定结果基本一致，除3 个种质在感病和抗病程度上有差异外，没有实质性的差异，说明枸橼对溃疡病抗性鉴定结果是比较稳定的。离体鉴定的感病种质症状比活体鉴定的发病快，有些感病种质的症状表现较严重，可能是离体环境湿度与温度偏高导致感病种质症状严重，但是离体叶片能保存的时间有限，不能作为最终鉴定结果。活体接种的叶片比离体接种的叶片观察时间更持久，本研究一直观察到接种后第45 d，部分感病叶片落叶后才停止观察，但是在接种第25 d 后症状基本稳定，没有出现新的发病症状，在稳定的温湿度条件下，活体接种第25 d 后基本可以判断种质的抗病或感病程度。因此，本研究结果表明，离体接种结果可以快速筛选，而活体接种结果更为准确。

研究柑橘溃疡病的抗性对柑橘种质资源的保存、珍稀品种的保护和今后抗病育种工作具有重要意义。枸橼C-05 是目前已报道的对柑橘溃疡病具有稳定抗性的柑橘属特异种质资源[8]。前人对枸橼的研究多用于果皮内含物，作为原始种抗病方面研究较少。王亚飞等利用香橼研究柑橘衰退病[23]；胡青波等[15]在田间试验发现6 个枸橼类品种与感病品种‘冰糖橙’之间均存在差异，故采用针刺涂菌接种法对其进行抗病性鉴定，小香橼、爪哇柠檬、大香橼、连南柠檬、广东香橼均表现出感病的症状，只是症状的严重程度都不及感病的‘冰糖橙’，且发病时间明显比‘冰糖橙’缓慢，与本研究注射接种鉴定结果一致，小香橼、大香橼和爪哇柠檬都表现感病，针刺涂菌接种法比本研究结果感病程度相对较轻，可能由于针刺涂菌接种法进入叶片的菌量少或者接种浓度不一致，所表现的症状表现也不太一致，也有可能田间环境湿度与温度变化差异大，感病症状表现不明显。本研究采用注射接种4 个溃疡病菌浓度进行鉴定，低浓度可以比较清晰地区别感病和抗病种质，但是103cfu/mL 溃疡病菌引起的病症反应要比104cfu/mL 溃疡病菌慢；高浓度（105～106cfu/mL）的溃疡病菌接种，病症形成快，但通常形成大块病斑，或大面积坏死，不易比较不同程度的感病或抗病性，因此，以104cfu/mL 的溃疡病菌作为接种浓度是比较合适的。

叶尖指数和叶形指数为重要的形态学标记[24]，孙珍珠等[25]发现不同宽皮柑橘品种的叶片形态差异显著。谭李梅等[26]研究发现，柠檬合子胚与珠心胚叶尖指数无差异，叶形指数存在显著差异，但不能作为区分合子胚与珠心胚实生苗的叶片形态学标记。本研究14 份枸橼种质的叶形指数和叶尖指数也存在显著性差异，小香橼、印度大果和爪哇柠檬的叶形指数与叶尖指数最小，叶片较相似，均呈卵圆形，而小香橼和爪哇柠檬属于感病种质，印度大果属于抗病种质；枸橼C-05 与美国枸橼和普通枸橼叶形较相似，呈长椭圆形，均属抗病种质；枸橼C-05 和大香橼的叶形指数与叶尖指数最大，枸橼C-05 极抗病，而大香橼感病。因此，枸橼种质之间叶形态具有差异，但与抗病性差异无关，推测有些枸橼种质叶片较相似可能与其亲缘性较近相关。

前期的研究表明，不同柑橘种类或品种对溃疡病抗性变化较大[27-28]，并且同一柑橘种类的不同品种的抗病性表现也不一致，对于溃疡病的抗病性表现相差数十倍以上[2]，与本研究结果相似。总之，本研究鉴定出与枸橼C-05具有类似抗性的园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼和印度大果，可为抗病基因的挖掘和抗病育种提供更多的种质资源。枸橼种质之间对溃疡病呈现极大的抗性差异，这种差异与其形态无关，说明枸橼C-05 的抗病性不是枸橼的非寄主抗性，抗病的几个枸橼是具有内在的独特抗病性，这对后续利用枸橼C-05 及其他抗病枸橼种质探明抗病机理和抗病育种有重要意义。