高能电子用于PET 瓶杀菌的研究

张国宏 陆健锋 于丽坤 谢骏琦

无论是超洁净灌装技术还是无菌灌装技术，在生产过程中对与产品直接接触的容器进行杀菌处理是不可缺少的工艺环节。目前，在使用化学方法对容器进行杀菌处理时，常常需要使用水冲洗或热分解来减少化学品的残留，这就带来了能耗问题和环保问题，同时，塑料材料对化学品的吸附也会对内容物的品质造成或多或少的负面影响。在当今环保压力日渐增大的大形势下，寻求一种安全、高效、节能、环保、经济的包装容器物理杀菌技术已成为行业发展的迫切需求。

高能电子杀菌技术属于辐射加工技术，目前，其已经获得FDA（美国食品药品管理局）的批准而投入使用。高能电子对微生物的杀灭分为直接作用和间接作用。直接作用是指DNA 分子本身因电离作用受损而导致细胞死亡。间接作用是指水分经辐射电离而产生各种游离基和过氧化物，其再与细胞内物质作用，从而使微生物失活。高能电子相对于钴60，虽然在穿透力方面有一定限度，但也有其明显的优势，如辐射时间短；输出功率可以控制；运转操作比较简单；不产生放射性废物；运行成本相对较低。高能电子杀菌技术现已广泛地应用于医疗用品、辐射食品等产品的灭菌，是一种安全、成熟的物理杀菌方法。本文对高能电子用于PET 空瓶的杀菌工艺及其工业化应用进行了初步研究。

1.材料及方法

1.1.剂量检测

1.1.1.剂量检测材料美国GEX 公司B3 WINdose 薄膜剂量计。

1.1.2.剂量检测方法

1.1.2.1.将剂量片贴于试验样品的相关位置上，执行辐射测试。

1.1.2.2.将处理后的剂量片取下，置于白纸上，在58.5℃烘箱中烘15min，然后用镊子直接把剂量片插入分光光度计测量位置，根据在552nm 处测定的吸光度，转算成剂量值。

1.2.微生物杀菌测试

1.2.1.菌种

1.2.1.1.短小芽胞杆菌ATCC 27142：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2.1.2.萎缩芽胞杆菌ATCC 9372：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2.2.芽胞悬液制作

按照《消毒技术规范》（2008 版）之2.1.2 菌悬液与菌片的制备执行。

1.2.3.样品接种

1.2.3.1.PET 片的接种：取菌液0.1mL，接种到PET 片上，接种面积控制在1cm2。接种后的PET 片放入干燥箱，在45℃下干燥30min 后用于测试操作。

1.2.3.2.PET 瓶的接种：取所需量的菌液，如为点接要求，则将菌液点滴到指定的位置；如为面接要求，则将菌液滴加到制定的区域，然后旋转或拍打空瓶，使菌液以小液珠形式均匀分散到指定区域的所有位置。接种后的空瓶置于45℃烘箱烘干30min，至菌液彻底干燥后用于测试操作。

1.2.4.样品辐射处理

1.2.4.1.离线辐射：将待测样品放入辐射屏蔽体中，固定待测样品与高能电子发射器的距离。按照高能电子发射器操作要求开启设备，待能量和束流稳定后，开始计时，计时结束后，降低束流和电压，关闭设备，取出待测样品。

1.2.4.2.在线辐射：开启空瓶辐射传输设备和高能电子发射器，待能量、束流及传输速度稳定至所需值后，将待测空瓶通过传输装置自动送入辐射屏蔽体中，对样品进行在线辐射处理，在屏蔽体出口处按照要求取出待测样品。

1.2.5.样品微生物检测

按照参照《消毒技术规范》（2008 版）之2.1.3 活菌培养计数技术执行。

2.结果与讨论

2.1.D10 值的测定

D10值是指杀灭90%微生物所需的辐射剂量（kGy）。D10值在电离辐射灭菌中对辐射剂量的估算占有重要地位。本试验中以PET 片为载体，通过存活曲线方法[1]测定萎缩芽胞杆菌和短小芽胞杆菌的D10值。

萎缩芽胞杆菌易于培养和计数，在测定高能电子能量（keV）对D10值影响时，使用萎缩芽胞杆菌可减少因培养计数的误差而产生的干扰。我们设定高能电子的不同能量，测定萎缩芽胞杆菌芽胞经不同剂量处理后的存活菌量，每个样品测三个平行样，取平均值作为一次测试结果，重复测试三次，结果见图1。

图1 不同能量下，剂量与萎缩芽胞杆菌芽胞的存活菌量对数值（log（N））的关系

对剂量与萎缩芽胞杆菌芽胞存活菌量的关系进行数据线性回归分析，由回归方程计算出其对应的D10值, 结果见表1。

表1 不同能量下，剂量与萎缩芽胞杆菌芽胞存活菌量变化关系回归分析结果

对于高能电子而言，其能量代表其穿透能力。通过数据比较发现，在150keV 时，接种干燥后的菌膜厚度对测试结果有一定的干扰，其D10值要明显高于300keV 和400KeV 下的值，产生“在较低的能量下，需要更大的杀菌剂量”这一假象。当能量增大到一定值后，菌膜厚度对测试结果的影响将大为减弱，300keV 和400keV 下的D10值接近。

在400keV 下，测定短小芽胞杆菌芽胞经不同剂量处理后的存活菌量，每个样品测三个平行样，取平均值作为一次测试结果，重复测试三次。结果与同能量下萎缩芽胞杆菌芽胞的存活菌量的对比见图2。

对剂量与短小芽胞杆菌芽胞存活菌量的关系进行数据线性回归分析，由回归方程计算出其对应的D10值, 结果见表2。

图2 400keV 下剂量与短小芽胞杆菌芽胞和萎缩芽胞杆菌芽胞的存活菌量对数值（log（N））的关系

表2 400keV 下剂量与短小芽胞杆菌芽胞和萎缩芽胞杆菌芽胞菌量变化关系回归分析结果

辐射灭菌法最常用的生物指示菌为短小芽胞杆菌芽胞[2]。表3 中罗列了部分文献中所报道的高能电子对短小芽胞杆菌芽胞杀灭的D10值。本测试中将菌量为106数量级的短小芽胞杆菌芽胞接种于PET 片上，测得的D10值为2.09，其值要高于文献报道值。

表3 不同文献中所报道高能电子对短小芽胞杆菌芽胞杀灭的D10 值

D.A. Cleghorn [10] Bacillus pumilus ATCC 27142 HEDP Radiachromic Films Far West Technology, Goleta, CA, USA 1.1 to 1.6 Glass fiber filter with non additives 1.6 Hitoshi ITO [11] Bacillus pumilus E601 Glass fiber filter with peptone+glycerin 2.1 Fricke dosimeter Cellulose filter with peptone+glycerin 1.7 Toru Hayashi [12] Bacillus pumilus E601 聚偏二氯乙烯涂层的聚丙烯 Fricke dosimeter 1.6

影响D10值大小的原因有很多，如芽胞的制备方法、干燥程度、载体的种类及辐射的均匀度等[4]。耿彦生[6]研究表明，电离辐射对布指示菌片、滤纸指示菌片、塑料指示菌片和可溶性菌片上的短小杆菌E601 的D10值分 别 为1.60、1.61、2.19、2.53。同时，齐子荣[13]研究表明，D10值又取决于照前菌数的多寡，以短小杆菌E601 芽胞为例，它在三种不同的照前菌数1.4×107、8.4×106、2.4×104、1.4×107个/ml 时，所得D10值分别为1.72、1.56、1.34，结果显示，照前菌数多，D10值高，反之则低。

除以上相关原因外，剂量检测方法以及试验装置也会影响到试验结果。本试验是在工业化装置上进行的理论曲线测试，由于所借用装置的特殊性，不能实现“即开即断”式的辐射，设备稳压、升束流和降压、降束流时产生的“无效剂量”会带入结果中，从而也会使得达到相同杀菌效果时的剂量要高于实际剂量。

萎缩芽胞杆菌ATCC 9372 是PET 无菌冷灌装生产线中包材化学法杀菌验证中使用的挑战菌。萎缩芽胞杆菌芽胞作为辐射杀菌工艺的生物指示菌也有报道[14][15]。在本测试中，萎缩芽胞杆菌的D10值要小于短小芽胞杆菌的D10值。

2.2.高能电子对PET 瓶内壁杀菌的离线测试

2.2.1.高能电子对PET 瓶内壁杀菌的剂量确定

2.2.1.1.高能电子对PET 瓶杀菌剂量上限设定

在一定剂量下，高能电子会与高分子材料发生交联或裂解反应。资料总结了电离辐射杀菌对商业用食品塑料包装材料的机械性能、塑料成分迁移量、阻隔性能及感官性能等方面的影响[16]。Geulas 等[17]对比了PP、PS 和 PET的抗辐射能力，结果发现在辐射量为60kGy 时，PP 和PS 的断裂伸长率分别降低了93%和61%，而PET 几乎没有受到影响。PET 是常用的包装材料中对辐射耐受能力最强的材料。资料表明[18]PET 对辐射最大容许剂量为1000～1500kGy。

我们以高能电子对PET瓶辐射处理后空瓶的颜色变化和恢复程度为指标，来确定高能电子对PET 瓶辐射剂量的上限。分别对添加绿色色母、白色色母和无色母添加的PET 瓶进行辐射处理，然后观察其颜色的恢复时间，结果见表4。

表4 添加不同色母的PET 瓶在不同能量和剂量下颜色恢复时间

我们通过试验发现，在一定辐射剂量下，辐射处理后的PET 瓶的颜色会发生变化，其后会逐渐恢复到正常。

图3 高能电子辐射PET 瓶后的色泽变化及其相关机理

汪辉亮对聚乙烯( PE) 辐射致色的主要原因进行了研究[19]，结果表明，PE 辐射后黄度的产生以及后期的消退主要是由生成的陷落自由基引起的。PET 瓶在经高能电子处理前后的颜色变化及其机理见图3，PET 分子链与捕捉到的电子形成自由基，自由基迁移形成酮醌式显色基团，放置之后，随着电子的释放，形成的自由基缓慢脱离或复位，酮醌式显色基团消失，PET 的颜色会逐渐恢复回来。试验数据显示，变色程度和恢复时间与高能电子的能量无关，而与剂量和所添加的色母有关。对于没有添加色母或添加绿色色母的PET 瓶，在70kGy 左右辐射后，其颜色在六天内基本颜色会恢复正常，而对于添加白色色母的PET 瓶，在70kGy 左右辐射后，其颜色需要在20 天以上才可能恢复正常。在使用高能电子对PET瓶进行杀菌时，考虑饮品实际生产的特点，我们初步确定将高能电子剂量限制在70kGy 以下。

2.2.1.2.高能电子对PET 瓶杀菌剂量下限设定

目前国际上常用的灭菌剂量（Sterilization Dose，SD）设定方法主要包括25kGy 单一剂量法、公式法和AMMI 方法。在世界上大多数国家或地区中，最低剂量为25 kGy， 但是在许多情况下，它显然高于必要水平[20]。辐射灭菌剂量也可由公式计算所得[18]：

其中：SD 为辐射剂量

D 为指示菌的D10值

N0为辐射前污染菌数

N 为辐射后残留菌数

SD 值大小主要取决于产品的初始污染菌类型、数量和无菌保证水平（SAL）。如果灭菌前污染微生物计数非常低，而且D10也很小，为了提高经济效应，避免产品的辐射损伤，也可采用较低的灭菌剂量[18]。研究表明，在一次性医疗用品上可降低辐射剂量[21]。对于一次性使用PVC 输液器，无菌保证水平取10-6，辐射灭菌剂量值选择为8～13kGy[22]。

资料表明，对于塑料容器，大约9kGy 就可以将短小芽胞杆菌ATCC 27142 芽胞杀灭到6log[9]。目前，随着PET 瓶在线吹制技术的广泛应用，相对于离线吹制，PET 瓶的初始染菌数量可大幅度降低并可有效控制。结合资料，本项目以9kGy 作为辐射剂量最低值作为探索方向。

2.2.2.高能电子对PET 瓶内壁杀菌的能量确定

采用高能电子对PET 瓶内壁进行杀菌的方法有多种[23]。在采用外照射法对PET 空瓶内壁进行杀菌时，空瓶各部分的厚度将会对高能电子杀菌效果有一定的影响。

高能电子发射器的能量决定了高能电子的穿透能力，能量越高，穿透的厚度就越大（见图4）。

图4 不同能量深度剂量分布曲线

PET 材料的密度为1.38g/cm3，计算所得不同能量高能电子所穿透的最佳厚度值（Ropt）见表5。

表5 不同能量所对应的PET 材料最佳厚度值

表6 测试用PET 瓶主要指标及剂量测试点

表7 不同能量下瓶身内壁不同点的剂量值

我们在不同能量下，测定了表6 所列参数的样品瓶瓶身内壁不同点的剂量值（见表7），其中表面剂量为PET瓶外壁离发射器最近点的值，虽然在试验中辐射参数一致，但由于试验装置的原因，开机和关机过程的操作过程会导致表面剂量值的波动。从表7 中可以看出，在350KeV，由于穿透厚度所限，PET 瓶内壁多个点的剂量＜3.4kGy，而在450keV，测试点的剂量均达到9kGy 以上，由于瓶底结构的特点，瓶底04 点和05 点是辐射的薄弱点。

表8 增加导向磁场前后，不同能量下瓶口内壁不同点的剂量值

PET 瓶口部分一般是整个瓶体中最厚的部分，在试验中单独对瓶口部分进行剂量测试，结果见表8。从数据可以看到，即使在450keV 下，瓶口部分仍有部分区域的剂量无法达到要求。在实际操作中，为了解决瓶口内壁剂量弱的问题，我们在瓶口上部增加导向磁场，通过导向磁场改变瓶口上部的高能电子的流向，将与瓶口平行的电子流导入到瓶口内。测试表明，导向磁场的设置，瓶口内壁的剂量值有增加的趋势，且各测试点的剂量均达到9kGy以上。

2.2.3.高能电子对PET 瓶内壁杀菌的微生物挑战测试

我们将确定的指示菌芽胞接种于PET 瓶身内壁剂量较小的05 点所在的瓶底及其04 点所在的瓶底四周边缘，以及接种于瓶口内壁，然后在450keV、1mA、20s 下对样品进行杀菌处理，其结果见表9 和表10。

表9 瓶底内壁指示菌芽胞杀灭对数值（KL）

表10 瓶口内壁指示菌芽胞杀灭对数值（KL）

试验结果表明，当我们将在空瓶灭菌的挑战测试中，接种于整个空瓶内壁的菌液量集中接种在剂量相对较小的区域时，经过高能电子杀菌处理后，杀灭对数值可以达到6log 以上，在某种程度上说明试验确定的高能电子杀菌工艺参数满足对整个空瓶6log 杀灭对数值的需求。

2.3.高能电子对PET 瓶内壁杀菌的在线测试

2.3.1.高能电子对PET 瓶杀菌内壁剂量测试

我们用蒙特卡罗模型对工业化实施中所需要使用的PET 瓶的瓶内壁各部分的剂量进行了模拟预判，从模拟结果看（见图5），由于受PET 瓶瓶型结构以及瓶壁厚度的影响，瓶口、瓶肩、瓶腰（logo 凹凸处）和瓶底部分是剂量的薄弱点。

图5 工业化PET 样品瓶内壁剂量的蒙特卡罗模拟

在24000 瓶/小时的运行速度下，我们对瓶肩、瓶腰和瓶底内壁的特定点进行了剂量测试，结果见表11、表12、表13 和表14。

表11 瓶口内壁辐射剂量测定值

表12 瓶肩内壁辐射剂量测定值

表13 瓶腰内壁辐射剂量测定值

表14 瓶底内壁辐射剂量测定值

测试结果表明，在选定的高能电子对PET 瓶内壁杀菌的工艺条件下，对于选定的测试点，其剂量均高于9kGy。

2.3.2.高能电子对PET 瓶内壁杀菌微生物挑战测试

我们针对蒙特卡罗模拟计算所示的空瓶内壁可能存在的辐射薄弱点，在24000 瓶/小时的运行速度下，对瓶口、瓶腰和瓶底内壁进行了指示菌芽胞杀灭对数值测试，结果见表15。

表15 空瓶内壁不同部位指示菌芽胞杀灭对数值（KL 值）

表16 高能电子对PET 瓶内壁指示菌芽胞杀灭对数值（KL 值）

表17 高能电子对异常PET 瓶内壁指示菌芽胞杀灭对数值（KL 值）

结果显示，在测试条件下，PET 瓶内壁测试区域对指示菌芽胞的杀灭对数值均＞6log。

在瓶口及空瓶内壁各区域通过微生物挑战测试后，在24000瓶/小时的运行速度下，我们对整个空瓶进行了指示菌芽胞杀灭对数值测试，考虑到高能电子杀菌装置的工位数量为45，我们确定测试样品数量不少于135 瓶（45 瓶/轮×3 轮），并重复测试三次，结果见表16。

测试结果显示，在测试条件下，除一瓶测试结果为5.84log外，其它样品对指示菌芽胞的杀灭对数值均超过6log。我们在不考虑测试操作误差情况下，对异常瓶进行了厚度检测，发现其瓶壁和瓶底与正常瓶相比都存在明显的差异。

为了解异常瓶对测试结果的影响，我们筛选了不合格瓶进行了测试，结果见表17。

如前所述，对于高能电子外照射工艺，PET 瓶的各部分厚度与内壁的剂量相关并影响到杀菌效果，结果表明，对于异常瓶，其对指示菌芽胞的杀灭对数值小于6log 的比例达到了44%。为了保证生产的安全性，控制吹瓶质量和保证空瓶各部分厚度的稳定性将成为品控重点。同时，从另一个层面也说明，高能电子外照射工艺更适合轻量化瓶的生产。

2.4.结束语

高能电子辐射加工技术是20 世纪90 年代以来才被广泛关注的高新技术，近年来发展势头迅猛。在PET 瓶杀菌方面，同传统的湿法杀菌（如PAA 法）和VPHP 干法杀菌相比，高能电子干法杀菌（EDS）技术具有无可替代的安全性、高效性和经济性，特别是在环保方面更是传统方法所无法相比的。随着环保需求的增强，以及EDS 杀菌装备工业化生产技术的成熟，在瓶装水、饮品和液体乳制品的生产中，相信EDS 技术将会突显其特殊的意义及价值。