V8 Nexus高速自动毛细管电泳仪血清蛋白电泳参考区间的建立

安崇文，李海霞，焦莉莉

（北京大学第一医院，北京 100034）

血清蛋白电泳（serum protein electrophoresis，SPE）是指采用电泳方法测定血清中各类蛋白质的百分比，对于肝脏疾病、肾脏疾病和多发性骨髓瘤的诊断有重要意义。目前，SPE的方法较多，有醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）等，不同方法的检测结果之间会有一定的差异。目前，采用CAME[1-2]和AGE[3-4]进行SPE的参考区间已有报道。国内采用CE进行SPE的仪器大多为Capillarys全自动毛细管电泳仪（法国Sebia公司），相关研究也是基于该仪器的结果[5]，有关V8 Nexus高速自动毛细管电泳仪（简称V8毛细管电泳仪）（CE法）检测SPE的参考区间国内尚未见报道。故本研究依据我国卫生行业标准WS/T 402—2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》[6]建立基于V8毛细管电泳仪的SPE参考区间，为其在临床中的应用提供帮助。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年7—9月北京大学第一医院体检中心进行健康体检的成年人，体检项目包括内科检查、外科检查、肝功能、肾功能、血糖、血脂、甲状腺功能5项、肿瘤标志物筛查、全血细胞分析、尿液全项分析、血压、胸片、心电图、B超等。依据我国卫生行业标准WS/T 402—2012[6]的要求制定入选标准：无家族病遗传病史，女性不在妊娠期或哺乳期，无心脑血管疾病，无肝、肾、肺、胰等重要器官功能障碍，近期无大量饮酒或酗酒，近期无手术史、住院史、输血史或服药史。最终入组表面健康者649名，其中男318名，年龄19～78岁；女331名，年龄18～85岁。按年龄分为5组：18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组及≥60岁组。不同性别之间年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 样本采集

样本的处理与储存按照WS/T 225—2002《临床化学检验血液标本的收集与处理》规定进行，研究对象样本采集前1天无大量饮酒、无剧烈运动、无高脂饮食，样本采集当日早上7：00—9：00，以坐姿在静息状态下采集空腹静脉血4 mL，注入含分离胶的采血管中，立即颠倒混匀5次以上，室温静置，3 h内以2 860×g离心5 min，分离血清，血清应无溶血、黄疸、脂血或乳糜血等，于8 h内采用V8毛细管电泳仪进行SPE。

1.3 仪器与试剂

V8毛细管电泳仪（英国Helena Biosciences Europe公司）及配套试剂[V8 Serum Protein SPE Kit（批号11412284）、V8 Storage Buffer（批号11531444）、V8 Maintenance Buffer（批号11518852）、Serum Control-Normal（批号11394452）、Serum Control-Abnormal（批号11404273）]。由于不同的电泳参数会对检测结果产生影响，故本研究严格控制电泳条件：试剂温度15 ℃、毛细管温度20 ℃、电压7.9 kV、Tris缓冲液pH10，电泳时间290 s，紫外光波长214 nm。

检测系统均严格执行质量控制，进行正常和异常室内质控品检测，结果均符合要求，批内、批间变异系数（coefficient of variation，CV）分别低于我国国家卫生健康委临床检验中心规定允许总误差的1/4和1/3。检测国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价和美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）发放的质控品，结果均合格。仪器操作严格按照生产厂商的要求进行，并准确无误地记录检测结果。

1.4 评价方法

依据我国卫生行业标准WS/T 402—2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》[6]建立参考区间。

1.5 统计学方法

采用Excel 2016、SPSS 13.0软件进行统计分析。采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验。呈正态分布或近似正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 离群值检查

将检测结果从小到大排列，计算全距或极差（R值）、极大值和极小值与其相邻值之差（D值）、极大值和极小值的统计量（Q值）。结果显示，男性和女性白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、γ球蛋白、β球蛋白的Q值均＜1/3，表明无离群值存在。

2.2 数据分布

计算所有数据的偏度系数和峰度系数及其各自的标准误，计算Z分数单位值和其概率P值，绘制带正态分布概率密度曲线直方图、P-P概率图和Q-Q概率图，初步评估正态性，采用Kolmogorov-Smirnov法进行检验。结果显示，男性组和女性组所有数据均服从正态分布或近似正态分布（P＞0.05）。

2.3 不同性别表面健康者的SPE结果

男性表面健康者白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白结果与女性表面健康者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），α1球蛋白、β2球蛋白和β球蛋白结果2个组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。依据WS/T 402—2012[6]要求进行Z检验，白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白和γ球蛋白的计算Z值高于界值表Z*值，说明男、女性之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。因此应考虑按性别分组，建立不同的参考区间。

表1 不同性别表面健康者SPE结果比较 %，±s

表1 不同性别表面健康者SPE结果比较 %，±s

注：与男性比较，*P＜0.05。

性别 例数 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白男性 318 64.11±2.84 3.72±0.51 5.94±1.30 6.43±0.86 4.29±0.73 15.51±2.39 10.71±1.32女性 331 61.87±2.75* 3.80±0.57 6.74±1.23* 6.66±0.75* 4.22±0.65 16.72±2.37* 10.87±1.14合计 649 62.96±3.01 3.76±0.54 6.35±1.32 6.54±0.81 4.25±0.69 16.13±2.46 10.80±1.23

2.4 不同年龄表面健康者的SPE结果

男性18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组及≥60岁组之间白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白差异均有统计学意义（P＜0.05），α1球蛋白、β2球蛋白、γ球蛋白和β球蛋白差异均无统计学意义（P＞0.05）。两两比较显示，18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白与≥60岁组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组之间差异均无统计学意义（P＞0.05），因此合并为19～59岁组。见表2。

表2 男性不同年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

表2 男性不同年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

注：与≥60岁组比较，*P＜0.05。

组别 例数 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白18～29岁组 63 64.54±2.94* 3.75±0.53 6.27±1.57* 6.15±0.93* 4.25±0.75 15.05±2.35 10.41±1.42 30～39岁组 113 64.32±2.55* 3.67±0.50 5.78±1.22* 6.36±0.88* 4.31±0.68 15.57±2.24 10.67±1.29 40～49岁组 74 64.06±3.04* 3.66±0.47 5.74±1.15* 6.61±0.81* 4.20±0.79 15.73±2.44 10.80±1.31 50～59岁组 46 63.91±2.40* 3.83±0.46 5.99±1.10* 6.60±0.68* 4.39±0.76 15.28±2.19 10.99±1.23≥60岁 22 62.43±3.60 3.85±0.65 6.42±1.51 6.60±0.81 4.37±0.63 16.33±3.27 10.97±1.24

女性18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组及≥60岁组之间白蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、β球蛋白差异均有统计学意义（P＜0.05），α1球蛋白、α2球蛋白和γ球蛋白差异均无统计学意义（P＞0.05）。两两比较显示，18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组白蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白、β球蛋白与≥60岁组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而18～29岁组、30～39岁组、40～49岁组、50～59岁组之间差异均无统计学意义（P＞0.05），因此合并为19～59岁组。见表3。

表3 女性不同年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

表3 女性不同年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

注：与≥60岁组比较，*P＜0.05。

组别 例数 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白18～29岁组 86 62.35±2.25* 3.79±0.54 6.83±1.18 6.49±0.78* 4.15±0.65* 16.39±2.01 10.65±1.21*30～39岁组 105 62.32±2.47* 3.76±0.58 6.62±1.18 6.58±0.74* 4.14±0.58* 16.58±2.30 10.72±1.07*40～49岁组 86 61.23±3.02* 3.85±0.59 6.63±1.21 6.85±0.78* 4.24±0.64* 17.20±2.34 11.09±1.10*50～59岁组 36 61.34±2.95* 3.73±0.52 6.88±1.34 6.74±0.58* 4.36±0.80* 16.95±3.17 11.10±1.16*≥60岁 18 61.03±2.68 3.96±0.56 7.30±1.43 6.76±0.60 4.60±0.67 16.35±2.59 11.36±1.05

采用LSD检验和SNK检验进行比较，男性≥60岁组白蛋白低于19～59岁组（P＜0.05）；女性≥60岁组β2球蛋白、β球蛋白高于19～59岁组（P＜0.05）。依据WS/T 402—2012[6]要求进行Z检验，Alb、β2球蛋白、β球蛋白的计算Z值低于界值表Z*值，说明≥60岁组与19～59岁组差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，可将19～59岁组与≥60岁组合并为一组，建立SPE的参考区间。见表4。

表4 不同性别、年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

表4 不同性别、年龄表面健康者SPE结果比较 %，±s

注：与同性别19～59岁组比较，*P＜0.05。

组别 例数 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β1球蛋白 β2球蛋白 γ球蛋白 β球蛋白男性19～59岁组 296 64.23±2.74 3.71±0.49 5.91±1.28 6.41±0.86 4.28±0.74 15.45±2.31 10.70±1.32≥60岁组 22 62.43±3.60* 3.85±0.65 6.42±1.51 6.60±0.81 4.37±0.63 16.33±3.27 10.97±1.24女性18～59岁组 313 61.91±2.75 3.79±0.57 6.71±1.21 6.65±0.76 4.20±0.65 16.74±2.36 10.85±1.14≥60岁组 18 61.03±2.68 3.96±0.56 7.30±1.43 6.76±0.60 4.60±0.67* 16.35±2.59 11.36±1.05*

2.5 男、女性SPE的参考区间计算

采用正态分布法计算男性和女性表面健康者SPE的95%可信区间和99%可信区间，各项目的参考区间见表5。

表5 不同性别表面健康者SPE的参考区间 %

3 讨论

CE是在传统电泳基础上发展起来的一种新型分离技术，其中毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）（又称自由溶液毛细管电泳），是CE最基本也是应用最广泛的一种分离方式。血清蛋白毛细管区带电泳是近十几年来迅速发展起来的。由于不同的检测系统之间采用的分离方法、电泳条件不尽相同，因此其检测结果可能会存在一定的差异[7-8]，而且不同地区的检测结果也可能存在一定的差异[9-10]，因此参考区间无法通用。

V8毛细管电泳仪的检测原理为CZE，本研究拟初步建立V8毛细管电泳仪SPE的参考区间。生产厂商声明的参考区间来自于美国人群，经过验证并不适用于本实验室。《全国临床检验操作规程》（第4版）给出的参考区间也引自试剂说明书，也不适用于本实验室。

本研究结果显示，男、女性SPE结果中白蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白差异均有统计学意义（P＜0.05），与文献报道[2，7]（CAME和AGE）相符。另外，张海晨等[11]的研究结果显示，男性溴甲酚绿化学法白蛋白的检测结果高于女性（P＜0.05），化学法球蛋白检测的结果低于女性（P＜0.05）。本研究结果显示，按年龄分组，男性≥60岁组白蛋白结果与19～59岁组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；女性≥60岁组β2球蛋白、β球蛋白结果与19～59岁组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；随着年龄的增长，男、女性白蛋白结果均呈缓慢下降趋势，与文献报道[2，7]一致。依据WS/T 402—2012[6]要求进行Z检验，白蛋白、β2球蛋白、β球蛋白的计算Z值低于界值表Z*值，说明≥60岁组与19～59岁组差异无统计学意义（P＞0.05）。

参考区间是否需要分组，不能单单考虑统计学分析结果，还应根据不同检验项目的临床意义进行判断[6]。对于SPE而言，最重要的就是发现并定量单克隆蛋白质，即M蛋白，许多疾病如B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、化学免疫抑制剂作用、原发性巨球蛋白血症、重链病、轻链病、原发性淀粉样变性、意义未明的单克隆免疫球蛋白血症、多神经病、皮肤黏液水肿样苔藓、多种慢性感染、结缔组织病、非网状内皮系统肿瘤、脂肪代谢障碍、慢性肝病、病毒感染、药物过敏、肿瘤、恶性淋巴瘤、自身免疫性疾病等均可能出现M蛋白[12]。另外，血清中多数有较高诊断意义的蛋白质都微量存在，其浓度改变一般不会对其所在的电泳区带产生明显影响，但弥漫性肝损伤、肝硬化、原发性肝癌、肾病综合征等肝、肾疾病患者以及慢性炎症、妊娠、无丙种球蛋白血症、双白蛋白血症患者的SPE结果可出现较明显的改变。基于SPE在临床中的价值，加上按年龄分层建立参考区间所需样本量太大且在日常工作中的实用性又不强，因此本研究未按年龄建立V8毛细管电泳仪SPE的参考区间。虽然男、女性之间SPE结果差异有统计学意义（P＜0.05），但考虑到临床应用意义不大，且传统的SPE检测也未按性别分别建立参考区间，因此各临床实验室应根据实际情况选择按性别分组还是不分组。

综上所述，本研究初步建立了V8毛细管电泳仪的SPE参考区间。但本研究仍有一定的局限性：（1）研究对象均来自同一家医院，属于单中心研究，代表性劣于随机分层抽样方式获得的参考人群；（2）纳入的研究对象年龄范围较窄，缺乏18岁以下和78岁以上人群的数据，60岁以上人群的例数偏少，这可能会影响该年龄段人群结果的可信性；（3）未纳入与经典的AGE的比对结果。因此，本研究结果仍需要多中心、大样本量的研究加以验证。