全自动免疫磁珠净化高效液相色谱法快速测定小麦中的呕吐毒素

邵亮亮 杜京霖 盛林霞 应美蓉 徐晨斌 章 程 李 燕

(1.浙江省粮油产品质量检验中心，杭州 310012； 2.浙江省粮食局直属粮油储备库， 杭州 311100)

小麦是世界最重要的谷物资源之一，也是我国的主要粮食作物，其质量安全关系到人们的身体健康和社会稳定。真菌毒素特别是呕吐毒素(Vomitoxin)是威胁我国小麦质量安全的主要因素之一。呕吐毒素也叫脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，是一种单端孢霉烯族毒素[1]，主要来自镰刀菌属，具有细胞毒性、免疫抑制、致畸作用及可能的弱致癌性，人和动物在误食被该毒素污染的食物后会导致各类急性中毒症状[2-4]。欧盟法规规定，作为口粮的小麦，DON含量不得超过1250 μg/kg[5]，我国食品安全国家标准GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》规定了小麦、麦片和小麦粉中呕吐毒素的限量均为1000 μg/kg[6]，超标的小麦及其制品不能作为储备粮也不能进入市场[7]。

国内外关于呕吐毒素检测的方法主要有薄层色谱法[8]、酶联免疫吸附法[9]、胶体金免疫层析法[10]、高效液相色谱法[11]、高效液相色谱串联质谱法[12，13]等。其中薄层色谱法由于溶剂消耗量大、重现性差等原因目前很少使用，酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法和真菌毒素快速检测仪法一般用于快速检测和大批量样品的初筛，容易出现假阴性和假阳性结果，不能作为准确定量法使用，而高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法能够精确定量，但前处理过程均需要采用免疫亲和柱净化、氮吹等前处理，过程繁琐、耗时过长。近年来，免疫磁珠富集净化法由于具有操作简便、分离快速和特异性强的优点，逐渐应用于真菌毒素检测[14-17]，但目前尚未制定呕吐毒素免疫磁珠净化的行业标准或国家标准。本研究采用的真菌毒素全自动免疫磁珠净化仪采用免疫磁珠富集净化技术，呕吐毒素经提取后，特异性地吸附在磁珠表面的抗体上，通过内置磁棒完成全自动高通量的磁吸、转移、洗涤和洗脱的全过程，搭配超高效液相色谱仪，完成样品中呕吐毒素的快速、准确的检测。本方法简化了前处理过程，提高了检测的自动化水平和检测效率，可以满足大批量样品的DON快速定量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)；JJHZ10型真菌毒素全自动净化仪(北京东孚久恒仪器技术有限公司)；LM3100型锤式实验室粉碎磨(瑞典Perten公司)；PL202-L型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)； EOAA-HM-01型多管漩涡混合器(上海安谱实验科技股份有限公司)；3-18K型离心机(德国Sigma 公司)；4204型电动分样器(美国Gamet公司)。

1.2 材料与试剂

呕吐毒素标准溶液(CAS：51481-10-8，浓度为199 mg/L，不确定度为±10 mg/L，上海安谱实验科技股份有限公司)；呕吐毒素净化试剂盒(北京东孚久恒仪器技术有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；聚乙二醇(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；小麦样品，由浙江省内小麦种植农户提供。

1.3 实验方法

1.3.1样品前处理

样品制备参考《粮食中真菌毒素标准、法规和检验》中的样品制备方法[18]，前处理方法参考国标GB 5009.111-2016《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法[19]，并结合呕吐毒素净化试剂盒使用说明书进行：小麦样品通过实验室粉碎磨进行粉碎，过20目晒网，准确称取5 g(精确到0.01 g)固体粉末样品于50 mL离心管中，加入1.0 g聚乙二醇和20 mL去离子水，涡旋振荡提取20 min，然后离心机6000 r/min离心5 min。用1 mL移液枪准确移取提取上清液1.0 mL加入试剂盒的1号样品孔中，将试剂盒放入真菌毒素全自动净化仪，按照设定的呕吐毒素净化程序开始净化。净化结束，用1 mL移液枪准确吸取0.5 mL去离子水至5号样品孔中，混合均匀后使用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中供高效液相色谱测定。

1.3.2标准溶液的配制

用移液管准确吸取0.5 mL呕吐毒素标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度为10.00 μg/mL的标准储备液。准确移取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用70 %的甲醇水溶液定容至刻度，得到0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL系列标准工作液，4 ℃保存。

1.3.3仪器条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相水+B相甲醇+C相乙腈(80+5+15)；柱温35 ℃ ；流速1.0 mL/min；进样量50 μL；检测波长：218 nm。

2 结果与讨论

2.1 试样前处理条件的选择与优化

由于小麦试样感染呕吐毒素并不均匀，不同籽粒、不同的部位所含呕吐毒素差异较大[20],为了保证试样的代表性和检测结果的准确性，需要大量取样以制备样品[21]，本实验将小麦样品混合均匀，通过分样器缩分至1 kg左右再通过实验室粉碎磨粉碎，混匀。试样称样量为5 g，便于在离心管中涡旋振荡提取，但同国标5009.111-2016相比称样量缩小了5倍。此外，国标法中洗脱液需先通过氮吹仪氮吹至近干，再用流动相定容至1.0 mL，而本实验为了快速测定，无需通过氮吹，改为在洗脱液(1.0 mL)中加入0.5 mL纯水，定容至1.5 mL。为了验证本方法的可行性，本实验选择了一个呕吐毒素含量为1163 μg/kg的小麦阳性样品，分别采用两种前处理方法(A：称样量5 g，涡旋提取，不氮吹，定容至1.5 mL；B：称样量25 g，振荡提取，氮吹，定容至1.0 mL)进行6次提取，比较结果的差异性，见表1。通过T检验可知，A法和B法测定结果之间没有显著性差异(P>0.05)，实验结论与文献一致[22]。

表1 两种DON测定前处理方法的结果比较

2.2 全自动免疫磁珠净化仪参数优化

由于小麦样品基质较复杂，待测液如果直接进行高效液相色谱测定会产生很多干扰峰，影响检测结果，因此进样前需要对待测液进行净化处理，本实验通过全自动免疫磁珠净化仪进行净化。全自动免疫磁珠净化仪净化过程见图1。净化过程就是磁棒带动磁珠在试剂盒各孔位之间的富集、清洗和洗脱等操作步骤。其中试剂盒1号孔位为样品上样和稀释孔，2号孔位为免疫磁珠孔，含磷酸盐缓冲液(PBS)，3、4号孔位为清洗孔，含Twen-20的磷酸盐缓冲液(PBST), 5号孔位为洗脱孔，洗脱液为甲醇。本实验设置的全自动免疫磁珠净化仪参数见表2。在此参数下，30min内能同时完成10个样品的净化。样品净化后，通过高效液相色谱测定可以有效去除提取液中的干扰物质，得到理想的色谱图(图2)。

图1 全自动免疫磁珠净化仪净化过程

表2 全自动免疫磁珠净化仪参数

2.3 液相色谱条件的选择和优化

通过紫外扫描，可知DON最大吸收波长在218 nm附近，故选择218 nm作为检测波长，此外通过二极管阵列检测器(DAD)可以对样品目标峰进行光谱分析，减少假阳性结果，因此本实验选择DAD检测器进行检测。

由于本方法不需通过氮吹，定溶液甲醇含量较高，而常用的流动相中有机相比例较低，液相分析时容易产生不同程度的溶剂效应，从而影响DON峰型，因此需要对流动相进行优化。实验采用3种流动相进行比较：A.水+甲醇=20+80，B.水+乙腈=20+80，C.水+甲醇+乙腈+20+5+15，实验发现，流动相为A时，溶剂效应影响很大，目标峰峰形很差，影响结果准确性；流动相为B时，无溶剂效应，目标峰峰形良好，但出峰提前，与溶剂峰和杂峰分离度较差；流动相为C时，无溶剂效应，目标峰良好，且与溶剂峰和杂峰等具有很好的分离度，DON在6min可完成分析，符合DON快速测定的要求。DON标准溶液(A)和样品(B)的液相色谱图如图2所示。

图2 DON标准溶液(A)和样品(B)的高效液相色谱图

2.4 标准曲线、线性范围和检出限

在优化的实验条件下，对6个不同质量浓度(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL)的DON标准溶液进行测定，以DON目标峰的峰面积为纵坐标(Y)，对应的质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，见图3，并根据信噪比(S/N)确定检出限(LODs，RSN=3)和定量限(LOQs，RSN=3)。如图所示，DON在线性范围内具有很好的线性关系，回归方程为Y=58.62X-0.34，相关系数为0.9999，检出限为40.9 μg/kg，定量限为136.4 μg/kg。

2.5 方法准确性

对23个具有不同DON污染水平的小麦样品，分别采用免疫亲和柱净化法(国标法)和全自动免疫磁珠净化法(仪器法)进行前处理，并测定DON含量(CDON)，比较结果的差异性和一致性。将样品分为轻度污染组(CDON≤1000 μg/kg)、中度污染组(1000 μg/kg2500 μg/kg)分别比较，结果见表3。

表3 仪器法与国标法测定结果比较

图3 DON标准曲线

通过SPSS配对T检验可知，DON轻度或中度污染的小麦样品(CDON≤2500 μg/kg)，采用国标法和仪器法进行前处理，DON测定结果没有显著差异(P>0.05)，通过Kendall一致性检验可知，DON轻度或中度污染的小麦样品采用两种净化法进行前处理，DON测定结果具有显著的一致性(Kendall渐进显著性P<0.05)，且一致性水平很高(K(W)≥0.98)；然而当小麦DON污染水平较高时(CDON>2500 μg/kg)，通过仪器法进行前处理测得的DON结果比国标法显著偏低(P<0.05)，两者结果不具有一致性(Kendall渐进显著性P>0.05)。出现偏差的原因是全自动免疫磁珠净化法测定DON污染水平较高的小麦样品时，样品提取液中的DON含量超过了免疫磁珠抗体的最大吸附量而出现吸附不完全，从而造成DON测定结果偏低。因此，对于重度污染的样品，提取时需要适当稀释，使DON含量在免疫磁珠最大吸附量范围内，即可保证测定结果的准确性。

2.6 回收率和精密度

向不含DON的小麦全麦粉中添加低、中、高3个浓度水平的DON标准溶液，按照全自动免疫磁珠净化仪设定的方法进行净化，并通过HPLC测定DON含量，每个加标水平平行测定6次，计算3个浓度水平下DON的加标回收率和相对标准偏差，结果如表4所示。在3个浓度水平下DON平均回收率在94.96～108.58 %范围内，相对标准偏差均小于5.0 %，说明该方法可靠，精密度良好，符合高效液相色谱法快速测定的要求。

表4 DON加标回收率(n=6)

2.7实际样品测定

采用1组10孔的呕吐毒素净化试剂盒，可以同时对10个小麦样品进行全自动免疫磁珠净化操作，本实验选择本地生产的10个不同品种的小麦样品，进行3次平行测定，结果如表5所示。10个小麦样品的相对标准偏差均小于10 %，符合国标GB 5009.111-2016第二法规定的精密度要求(<23 %)。受种植环境的影响，本实验选择的10个不同品种小麦中均检出DON，且含量有较大差异，其中镇麦12和镇麦168的DON含量超过国标限量(1000 μg/kg)，而苏麦188和扬麦23的DON含量较低。

表5 不同品种小麦中DON含量

续表5

3 结论

采用全自动免疫磁珠净化法对小麦样品进行净化处理，通过高效液相色谱快速测定DON含量。小麦样品前处理中通过全自动免疫磁珠净化仪进行批量净化，节省大量的人力和时间，样品无需通过氮吹，可以直接通过条件优化后的高效液相色谱法进行测定，在6 min内就能进行准确定量。该方法快速、准确，回收率和精密度高，并能达到良好的分离效果，适用于实验室对批量小麦中DON的快速测定。